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Traitement distinct de la nociception dans les régions dysgranulaires et cylindriques du cortex somatosensoriel de la souris
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Traitement distinct de la nociception dans les régions dysgranulaires et cylindriques du cortex somatosensoriel de la souris

May 20, 2023

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3622 (2022) Citer cet article

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La nociception, un aspect somatique discriminant de la douleur, est, comme le toucher, représentée dans le cortex somatosensoriel primaire (S1), mais la séparation et l'interaction des deux modalités au sein de S1 restent floues. Ici, nous montrons un traitement tactile et nociceptif spatialement distinct dans le champ de baril granulaire (BF) et la région dysgranulaire adjacente (Dys) chez la souris S1. Des enregistrements simultanés de l'activité multi-unités dans les sous-régions ont révélé que les neurones Dys sont plus sensibles aux entrées nocives, alors que les neurones BF préfèrent les entrées tactiles. Au niveau du neurone unique, les informations nociceptives sont représentées séparément des informations tactiles dans la couche Dys 2/3. En revanche, les deux modalités semblent converger sur les neurones individuels de la couche 5 de chaque région, mais à un degré différent. Dans l'ensemble, ces résultats montrent un traitement spécifique à la couche des informations nociceptives et tactiles entre Dys et BF. Nous avons en outre démontré que l'activité Dys, mais pas l'activité BF, est impliquée de manière critique dans le comportement de type douleur. Ces résultats fournissent de nouvelles informations sur le rôle du traitement de la douleur dans S1.

Le cortex somatosensoriel primaire (S1) joue un rôle central dans le traitement de l'information tactile1. La représentation tactile dans S1 est ordonnée de manière somatotopique2. D'autre part, S1 est responsable des aspects somatiques discriminatoires du traitement de la douleur, tels que l'emplacement, l'intensité et la qualité de la douleur3,4,5,6,7,8,9,10. S1 reçoit des informations nociceptives thalamocorticales11 et les relaie à d'autres zones corticales liées à la douleur, telles que le cortex cingulaire antérieur, qui est responsable des aspects affectifs de la douleur12,13. S1 module également les entrées nocives via les voies corticotrigéminales14 et corticospinales15 dans des conditions de douleur aiguë et chronique. Par conséquent, S1 peut être considéré comme une plaque tournante du réseau de traitement de la douleur et une cible pour les interventions visant à contrôler la douleur. Cependant, on ne sait toujours pas comment S1 traite les informations nociceptives et les informations tactiles somatiques de manière distincte.

La souris S1 est divisée en deux sous-régions en fonction de sa cytoarchitecture : la région granulaire connue sous le nom de champ de tonneau (BF), qui est identifiée par des grappes uniques de neurones de la couche (L4), et la région dysgranulaire adjacente (Dys), qui a mal défini L46,16. On pense que les deux sous-régions sont fonctionnellement différentes. Par exemple, BF est le centre de traitement des entrées tactiles des moustaches17,18,19, tandis que Dys reçoit les entrées proprioceptives des stimulations musculaires profondes ou des rotations articulaires20,21. Dans la nociception, les neurones BF des couches plus profondes reçoivent des entrées nocives11,22,23. De même, les neurones Dys dans les couches plus profondes répondent aux pincements nocifs et aux entrées pruriceptives24,25. Cependant, la façon dont chaque sous-région traite les informations nociceptives avec/sans informations tactiles reste inconnue car une comparaison directe entre les deux sous-régions fait défaut.

Ici, nous avons constaté que les informations nociceptives et tactiles ont tendance à être représentées séparément dans Dys et BF, respectivement, en enregistrant simultanément les deux sous-régions. Dys était également principalement activé dans des conditions de douleur neuropathique produites par une lésion du nerf périphérique. Reflétant la représentation spatialement distincte de la nociception, l'inhibition optogénétique de l'activité neuronale de Dys, mais pas de BF, a réduit le comportement douloureux induit par les entrées nocives. Ainsi, nous avons clarifié un rôle fonctionnel distinct dans le traitement de la douleur chez Dys, qui génère un comportement d'échappement approprié à partir d'entrées nocives.

Tout d'abord, nous avons comparé les propriétés de réponse entre Dys et BF lors de stimuli thermiques nocifs (noxH ; 45 à 50 °C) appliqués à un coussinet de moustaches (Fig. 1a). Bien que les septa au sein de BF appartiennent à la région dysgranulaire en termes de cytoarchitecture, nous avons désigné la zone dysgranulaire entourant BF comme Dys. Nous avons enregistré simultanément les activités multi-unités (MUA) des neurones Dys et BF en L2/3, L4, L5a et L5b. Le MUA dans Dys a augmenté dans toutes les couches enregistrées lorsque la température du dispositif Peltier a atteint une plage nocive (45 à 50 ° C), tandis que les réponses différaient entre les couches dans BF : MUA à noxH n'a pas augmenté en L2/3 ou L4 mais légèrement augmenté en L5a (Fig. 1b). Pour évaluer la préférence pour noxH, le rapport signal sur bruit (S/N ; voir Méthodes) a été calculé. La réponse à noxH (étiquetée S, région ombrée beige sur la Fig. 1b) a été utilisée comme signal, et la réponse à une plage de chaleur inoffensive (33–45 °C, étiquetée N, région ombrée grise sur la Fig. 1b) a été utilisé comme bruit. Les comparaisons de paires de neurones enregistrées simultanément ont montré que les neurones Dys sont plus sensibles à noxH que les neurones BF (Fig. 1c, P = 0, 0056 pour L2 / 3, 0, 0056 pour L4 et 0, 049 pour L5a, n = 8 animaux). Lors de la comparaison des valeurs S/N pour les mêmes couches entre Dys et BF, le S/N dans Dys était significativement plus élevé que dans BF en L2/3 (P = 0,89 × 10−4, test de comparaisons multiples, Fig. 1d). Au sein de BF, le S/N était significativement plus élevé en L5a qu'en L2/3 (P = 0,03, Fig. 1d). Cette différence entre les couches pour les réponses noxH dans BF est cohérente avec les études précédentes22,23,26. Cette tendance a également été observée lorsque la réponse du dispositif Peltier à température constante (environ 30 °C) a été utilisée comme signal de bruit pour calculer le S/B. Ensemble, le MUA de Dys a montré une plus grande sensibilité à noxH que BF (Fig. 1e). Nous avons également examiné l'expression de c-Fos, un marqueur de l'activité neuronale, dans la zone de S1 qui répond à une entrée nocive après l'injection de capsaïcine dans le coussinet des moustaches (Fig. 1a supplémentaire). Pour différencier Dys et BF, nous avons co-immunocoloré avec NeuN et VGluT2, marqueurs pour les neurones et les terminaux thalamocorticaux, respectivement (Fig. 1b supplémentaire). Le nombre de neurones c-Fos-positifs a augmenté de manière significative dans L4 de Dys (P = 0,0027) et L5a de BF (P = 0,0249, Fig. 1c supplémentaire). Ainsi, nous avons confirmé les apports nocifs activés des couches superficielles en Dys et L5a en BF.

a Configuration pour des enregistrements simultanés de Dys et BF tout en appliquant des stimuli de chaleur nocive (noxH) au coussinet de moustache gauche. Une section du cerveau montrant des pistes d'électrodes (DiI, rouge). La coloration VGluT2 (vert) montre la frontière de Dys et BF. Barre d'échelle, 500 μm. b PSTH d'enregistrements MUA représentatifs à noxH dans L2/3, 4 et 5a de Dys et BF. Les zones ombrées indiquent les régions pour le calcul des rapports S/N. c Un nuage de points de S/N d'activités multi-unités enregistrées simultanément en réponse à un stimulus noxH. P = 0,000023 pour L2/3 (n = 25), 0,0056 pour L4 (n = 17), 0,049 pour L5a (n = 16) et 0,69 pour L5b (n = 6) par le test bilatéral des rangs signés de Wilcoxon. La diagonale indique l'unité. d Comparaison statistique des réponses S/N à noxH. *P = 0,030, **P = 0,89 × 10−4 par le test de Kruskal–Wallis suivi du test de Sidak ; n = 8 animaux. Boîtes à moustaches (médiane avec les 25e et 75e centiles). Les points de données au-delà des moustaches sont indiqués par les points. e Un schéma récapitulatif indiquant les régions nociceptives en S1.

Nous avons ensuite évalué la préférence de réponse aux stimuli tactiles en comparant le S/N en réponse aux déviations des moustaches (voir Méthodes). Les neurones de BF ont répondu précisément au début de chaque déviation des moustaches, contrairement à ceux de Dys (Fig. 2a, b). Le S / N aux déviations des moustaches était plus élevé dans BF que Dys dans chaque couche (Fig. 2c, d), indiquant que les réponses BF étaient plus fortes que les réponses Dys aux stimuli tactiles (Fig. 2e). Étant donné que le coussinet de moustache a été directement stimulé par la chaleur, nous avons testé sa réponse à la stimulation tactile en plaçant un pinceau dans le coussinet de moustache (c'est la position équivalente au stimulus thermique) et avons confirmé que BF préfère les stimuli tactiles à Dys (Fig. 2).

une configuration pour enregistrer les réponses de Dys et BF à la stimulation tactile des moustaches. La zone ombrée indique le temps utilisé comme signal (S) et bruit (N) pour calculer le S/N de l'entrée tactile. b Exemples de PSTH de MUA à des stimuli tactiles dans L2/3, 4 et 5a de Dys et BF enregistrés en même temps (voir aussi Fig. 1e). c Un nuage de points de S/N de MUA enregistré simultanément aux stimuli tactiles. P = 0,0038 pour L2/3 (n = 25), 0,028 pour L4 (n = 17), 0,0002 pour L5a (n = 16) et 0,063 pour L5b (n = 6) par le test bilatéral des rangs signés de Wilcoxon . La diagonale indique l'unité. d S/N à un stimulus tactile était plus élevé en BF L2/3. **P = 5,4 × 10−4 par le test de Kruskal–Wallis suivi du test de Sidak ; n = 8 animaux. Boîtes à moustaches (médiane avec les 25e et 75e centiles). Les points de données au-delà des moustaches sont indiqués par les points. e Un schéma récapitulatif indiquant les régions de préférence tactile en S1.

Les résultats de l'analyse MUA ont indiqué qu'il existe des biais spatiaux pour le traitement de l'information nociceptive entre Dys et BF (Fig. 1). Ainsi, nous avons examiné la spécificité de modalité des neurones uniques dans deux sous-régions. L2/3 et 5 sont les couches de sortie corticales qui établissent des connexions avec les cortex moteur et cingulaire antérieur, qui sont impliqués dans le comportement douloureux13,27. Les histogrammes de temps péristimulus (PSTH) de neurones bien isolés dans L2/3 enregistrés simultanément à partir des deux sous-régions sont illustrés à la Fig. 3a; les neurones enregistrés ont été triés en fonction du moment de la réponse maximale à un stimulus thermique. Dans Dys L2/3, la pente des réponses maximales à un stimulus thermique a augmenté dans la plage de chaleur nocive, indiquant que la majorité des neurones Dys ont répondu à la chaleur nocive. En revanche, seuls quelques neurones ont répondu dans BF L2/3 (encadré blanc sur la Fig. 3a, colonne de gauche). D'autre part, de nombreux neurones BF L2/3 ont bien répondu aux stimuli tactiles. Notamment, les neurones nocifs répondant à la chaleur dans Dys L2 / 3 n'ont pas répondu aux stimuli tactiles (encadré blanc sur la figure 3a, colonne de droite).

a PSTH pour les réponses des mêmes neurones dans L2/3, L5a et L5b à des stimuli de chaleur nocive (noxH) (à gauche) et tactiles (à droite). 50 ms/bin pour le stimulus thermique et 5 ms/bin pour le stimulus tactile. Chaque ligne a été triée par le temps de réponse maximal pour noxH, et le taux de déclenchement a été normalisé par la réponse maximale (zones encadrées) dans chaque ligne. b Valeurs moyennes des histogrammes des panneaux a et b triés en fonction du S / N à noxH et des stimuli tactiles: cellules nociceptives, tactiles, intégratives (nociceptives et tactiles) et non réactives (aucune) (voir Fig. 3 supplémentaire) . *P < 0,05 versus non réactif (test de Kruskal-Wallis bilatéral suivi du test de Tukey). Les ombrages indiquent les SEM. c Répartition des types de cellules dans L2/3, L5a et L5b de chaque zone et un schéma récapitulatif. d Distributions des seuils thermiques déterminés à partir de la température à laquelle les réponses neurales ont atteint 80 % du taux de pointe maximal. En L2 / 3 et L5b, les neurones Dys étaient réglés sur la chaleur nocive, tandis que les neurones BF répondaient à diverses températures (* P = 0, 013, ** P = 0, 005, test Ansari – Bradley à deux échantillons pour les dispersions). e Pourcentages de neurones pour lesquels les réponses ont été supprimées (S/N < 1). ***P = 5,4 × 10−8, test 2 × 2 χ2 entre BF et Dys.

La pente des réponses maximales aux stimuli thermiques a augmenté dans la plage de chaleur nocive dans les deux régions dans les couches plus profondes (boîtes blanches dans L5a et L5b sur la figure 3a, colonne de gauche). Cette tendance indique que les neurones nociceptifs ont augmenté dans les couches plus profondes. À l'exception de Dys L5a, les neurones nociceptifs de L5 avaient tendance à répondre également aux stimuli tactiles (encadrés blancs sur la Fig. 3a, colonne de droite). Ainsi, les neurones Dys de L2/3 traitent les informations nociceptives séparément des informations tactiles, tandis que les neurones de L5 ont tendance à répondre à la fois aux entrées tactiles et nocives.

Pour quantifier ces observations, nous avons classé les neurones en types nociceptifs, tactiles, intégratifs et non réactifs en fonction du S/N à noxH et des stimuli tactiles (Fig. 3b et Fig. 3 supplémentaire). Les distributions du S/N ont été regroupées en fonction du S/N médian pour tous les neurones enregistrés (1,46 pour les nociceptifs et 1,81 pour les tactiles, Fig. 3b, d, f, g supplémentaires). De plus, les PSTH normalisés des neurones classés selon ces valeurs représentaient les caractéristiques de chaque groupe de neurones (Fig. 3b) : les neurones de type nociceptif répondaient à la chaleur nocive mais pas aux stimuli tactiles, les neurones de type tactile répondaient aux entrées tactiles mais pas aux chaleur nocive et les neurones de type intégratif ont répondu aux deux stimuli. Par conséquent, nous avons utilisé le S/N médian comme valeur seuil pour la classification. Selon cette classification, le pourcentage de neurones de chaque type dans chaque sous-région a été calculé (Fig. 3c). Conformément à la population PSTH (Fig. 3a), dans la majorité des neurones de L2/3, les informations nociceptives étaient traitées séparément dans Dys tandis que les informations tactiles étaient traitées dans BF. De plus, de nombreux neurones de type tactile dans Dys L2 / 3 avaient des latences d'apparition relativement plus longues à la stimulation tactile que ceux de BF L2 / 3 (Fig. 4 supplémentaire), ce qui suggère que ces neurones reçoivent des informations tactiles de BF. En revanche, la latence d'apparition des neurones de type intégratif dans les L2/3 des deux régions était plus longue (Fig. 4 supplémentaire).

Dans les couches plus profondes, les informations nociceptives et tactiles ont été intégrées dans la majorité des neurones des deux sous-régions (Fig. 3c, en bas).

Étant donné que les neurones Dys et BF dans les couches plus profondes répondaient principalement à une stimulation thermique nocive, nous avons également examiné les réponses neuronales à des stimuli mécaniques nocifs22. Nous avons examiné les réponses évoquées à un stimulus mécanique nocif de von Frey (10 g) (Fig. 5 supplémentaire). Le MUA de Dys et BF dans L5b a augmenté lors de l'application d'un filament von Frey pondéré de 10 g (Fig. 5a supplémentaire). Le MUA de BF L5b et Dys L5b a atteint une réponse maximale lorsque le filament de von Frey s'est plié (c'est-à-dire que le coussinet de moustache a été stimulé à 10 g, Fig. 5b supplémentaire). La pente des réponses maximales à la stimulation nocive a augmenté dans Dys L5b et BF L5b (Fig. 5b supplémentaire), indiquant que de nombreux neurones dans les couches plus profondes répondent également à une stimulation mécanique nocive.

Dans la population PSTH (Fig. 3a), le début de la réponse aux stimuli thermiques variait d'un neurone à l'autre, en particulier dans BF L2 / 3 et L5b, indiquant que les neurones répondaient à différentes températures. Par conséquent, nous avons examiné la sensibilité à la température à partir du seuil thermique (réponse maximale de 80 %) des neurones en réponse au stimulus thermique (Fig. 3d). Les neurones L2/3 des deux régions ont commencé à répondre à des températures inoffensives (–44 °C). Les distributions du seuil thermique des neurones Dys, mais pas des neurones BF, se sont accumulées de manière significative autour de la plage de chaleur nocive en L2/3 (P = 0,013) et L5b (P = 0,0051) (Fig. 3d). Ces données suggèrent que les neurones Dys sont bien adaptés à la température de chaleur nocive, alors que les neurones de BF L2/3 et L5b codent pour les températures cutanées28,29.

Les PSTH moyens (Fig. 3b) montrent que les activités neuronales des neurones tactiles et non réactifs ont été supprimées par noxH. Parce que le S/N de ces neurones était <1, nous avons estimé le pourcentage de neurones supprimés par noxH dans chaque région. Dans BF L2 / 3, 60% des neurones ont été supprimés par noxH (Fig. 3e). Ce pourcentage est significativement supérieur à celui de Dys (22 %, P = 5,4 × 10−8). Ces données peuvent expliquer le mécanisme neuronal qui sous-tend les déficits de la capacité discriminative perceptive tactile en cas de douleur30,31.

En résumé, les données montrent que les informations nociceptives sont traitées séparément des informations tactiles dans la couche superficielle de Dys et BF et ont tendance à être intégrées dans des couches plus profondes. La différence de seuils thermiques indique que Dys traite l'apport de chaleur nocif et que BF est responsable du codage de la température.

Nous avons ensuite examiné si l'activité Dys implique le traitement de la douleur dans des conditions physiopathologiques. Il a été proposé que S1 est activé dans la douleur chronique12,13,32,33 et que la lésion des fibres nerveuses périphériques provoque une réorganisation somatotopique et une hypersensibilité mécanique34,35,36,37,38,39. Par conséquent, nous avons appliqué un modèle de névralgie du trijumeau par ligature du nerf infraorbitaire (ION) et étudié comment l'activité corticale spatiale change dans S1 au cours du développement de l'allodynie mécanique. Dans ce but, nous avons utilisé un fil chirurgical résorbable (voir Méthodes), qui nous a permis d'observer l'état d'allodynie mécanique et l'état de récupération chez le même animal.

Nous avons d'abord examiné l'évolution temporelle du développement de l'allodynie mécanique par la ligature ION, qui a été évaluée par le seuil d'échappement dans le test de filament de von Frey. Les souris ont montré une allodynie lorsque la résistance à la traction du fil chirurgical était d'environ 50% et se sont rétablies lorsque la résistance à la traction a été réduite à 0% de la résistance maximale (Fig. 6 supplémentaire).

Ensuite, nous avons enregistré les signaux intrinsèques induits par la stimulation des moustaches en continu du même animal avant et pendant l'état d'allodynie mécanique (POD7) et l'état de récupération (POD21, Fig. 4a, b). Des signaux intrinsèques évidents dans BF induits par la stimulation des moustaches ont été observés avant la ligature (Fig. 4b, à gauche). À l'état d'allodynie (POD7), le signal dans BF a disparu mais s'est amélioré dans la région adjacente (Fig. 4b, milieu), bien que le contraste du signal soit relativement faible (Fig. 4b). A l'état de récupération (POD21), le signal en BF est réapparu (Fig. 4b, à droite). Après une série d'enregistrements, nous avons confirmé que la région adjacente de BF, où le signal a été détecté à POD7, était Dys dans une analyse histologique ultérieure (Fig. 4c et Fig. 7 supplémentaire).

un schéma montrant l'imagerie du signal intrinsèque lors de la stimulation des moustaches par le dispositif piézo. Une LED rouge a été utilisée pour l'imagerie du signal intrinsèque, et une LED verte a été utilisée pour obtenir le modèle de vaisseau de la surface du cerveau. b En haut, Schéma de l'évolution temporelle de la ligature du nerf infraorbitaire (ION) par un fil chirurgical résorbable. Milieu, exemples typiques des images de signal intrinsèque d'un animal. En bas, images superposées de la région du signal (jaune) et du modèle de vaisseau utilisé pour l'alignement. c Coloration au cytochrome c oxydase d'une coupe tangentielle de S1 L4. FP, patte avant ; HP, patte arrière. d Images à score z moyen (groupe de ligature, n = 5 ; groupe fictif, n = 3). Les zones en pointillés indiquent BF activé par la stimulation des moustaches avant la ligature. R, rostrale ; L, latéral ; POD, jour postopératoire. Barres d'échelle, 1 mm.

Pour confirmer l'activité neuronale Dys pendant la ligature et la récupération, nous avons enregistré le MUA évoqué par le stimulus dans Dys et BF à POD7 et POD21 chez des animaux individuels (Fig. 8a, b supplémentaires). L'équilibre de l'activité entre BF et Dys a été modifié (Fig. 8a, b supplémentaires). L'activité Dys était plus élevée que dans BF chez certains animaux lors de la ligature à POD7 (Fig. 8a supplémentaire); de plus, l'activité BF a récupéré à POD21 (Fig. 8b supplémentaire). L'imagerie du signal intrinsèque résulte de la sommation spatiale de l'activité neuronale et les enregistrements électrophysiologiques de l'activité neuronale localisée peuvent donc sous-estimer les changements dans l'activité Dys. En conséquence, nous avons également compté les neurones positifs à c-Fos chez les souris après que les souris aient exploré un environnement enrichi40,41 (voir Méthodes, Fig. 9a supplémentaire). Conformément aux résultats d'imagerie du signal intrinsèque, le nombre de neurones c-Fos-positifs a augmenté de manière significative dans Dys mais a diminué dans BF à POD7. Cependant, à POD21, le nombre de neurones c-Fos-positifs dans BF a été récupéré (Fig. 9b, c supplémentaires). Ainsi, la région activée changeait dynamiquement en fonction de l'étendue de la lésion nerveuse périphérique, et l'activité neuronale dans Dys était augmentée dans l'état douloureux.

Enfin, nous avons examiné si Dys est impliqué dans un comportement de type douleur, tel que la fuite de stimuli nocifs. Pour cela, nous avons surveillé les comportements d'animaux attachés à la tête se déplaçant librement sur un tapis roulant sphérique42 en réponse à un laser infrarouge (IR) inoffensif ou nocif appliqué sur le coussinet de moustache gauche (Fig. 5a). L'application du laser IR pendant 500 et 1500 ms augmente la température de la peau à 39 °C et 52 °C, respectivement43, que nous appelons ainsi chaleur inoffensive (innH) et noxH, respectivement. En réponse à noxH, la vitesse de déplacement a augmenté jusqu'à 5 s après le début du stimulus laser IR et la direction de course a changé vers le côté opposé à l'entrée nocive alors que les souris tentaient de s'échapper de l'entrée nocive (Fig. 5b – d et Fig. 10a supplémentaire, Direction). Les animaux ont également présenté des clignements et des contractions des yeux (Fig. 10a supplémentaire), qui sont considérés comme des expressions de la douleur44,45,46. Ainsi, ce système convenait pour quantifier les comportements de type douleur en réponse à noxH.

un schéma de surveillance du comportement d'évasion induit par l'application d'un laser infrarouge (IR) de 808 nm sur le coussinet de moustache gauche d'un animal en mouvement libre à tête retenue sur un tapis roulant sphérique. La direction et la vitesse du mouvement ont été surveillées par une caméra à l'arrière, et l'expression faciale et le mouvement des membres antérieurs ont été surveillés par des caméras latérales. b Exemples de vitesse d'échappement en réponse à des stimulations IR de 500 et 1500 ms, correspondant à 0,09 (chaleur inoffensive, innH) et 0,27 J/mm2 (noxH), respectivement. c Profils de vitesse moyenne avec (innH, orange ; noxH, rouge) et sans (noir) stimulation IR (n = 6 souris). *P < 0,05, **P < 0,01. d Vitesses maximales induites par stimulation IR (n = 6 souris, ns, non significatif ; **P = 3,1 × 10−6 (No Stim. vs noxH), 0,0055 (innH vs nox H) ; ANOVA unidirectionnelle suivie de la Test de Tukey-Kramer.). e Schéma pour faire taire six positions S1 (espacées de 430 μm) via une photoactivation à 473 nm de la channelrhodopsine-2 (ChR2) pendant la stimulation noxH. Barre d'échelle, 1 mm. +, bregma ; R, rostrale ; L, latéral ; D, dorsale. f Les profils de vitesse moyenne montrent que la suppression optogénétique à P3 (bleu) ou P4 (cyan) a considérablement réduit la vitesse d'échappement à noxH (n = 6 souris). *P < 0,05. g Scores z moyens de la vitesse maximale (n = 6 souris). **P = 2,3 × 10−5 (noxH contre P3), 2,0 × 10−4 (noxH contre P4) ; ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Tukey-Kramer. Les barres d'ombrage et d'erreur indiquent les SEM pour les souris.

En utilisant ce système, nous avons examiné l'effet de la modulation de l'activité Dys sur le comportement douloureux. Nous avons surveillé les comportements de type douleur induits par noxH lors de la suppression optogénétique de diverses zones corticales, y compris Dys (Fig. 5e). Pour cette expérience, nous n'avons pas évalué le clignement ou le resserrement des yeux, qui impliquent des actions réflexes via le tronc cérébral et le cervelet47. Nous avons utilisé une lignée transgénique qui exprime la channelrhodopsine-2 (ChR2)-EYFP dans des interneurones exprimant la parvalbumine (PV) (PV-Cre × Ai32) et photoactivé les interneurones PV pour inhiber localement les neurones pyramidaux corticaux48,49,50 (Fig. 5e) . Étant donné que Dys est une région étroite (environ 0,4 mm) adjacente à BF (coupe tangentielle, Fig.4c), il est difficile de stimuler Dys tout en excluant BF ou la région de la patte. Nous avons donc modifié les positions de stimulation laser en six points puis comparé les comportements48,50. La photoinhibition en position 3 (P3) et P4, qui couvrait principalement Dys et partiellement la région de la patte ou BF, diminuait significativement la vitesse d'échappement en réponse à noxH (1,5 à 2 s à P3 et P4, P < 0,05 ; et 2 à 2,5 s à P4, n = 6, figure 5f). En revanche, la photoinhibition d'autres régions S1, telles que les régions BF ou patte, n'a eu aucun effet (P> 0, 05, Fig. 11 supplémentaire). Des tendances similaires ont été observées pour la vitesse maximale (P <0, 01 à P3 et P4, non significatif à d'autres positions, Fig. 5g), et pour les changements dans la direction et la distance d'échappement (Fig. 10b supplémentaire). En résumé, nous avons confirmé que la photoinhibition à P3 et P4 supprimait le comportement d'échappement des souris courant dans la direction opposée à l'entrée nocive. Chez les souris témoins qui n'exprimaient pas ChR2, la stimulation au laser bleu n'a pas affecté la vitesse d'échappement (Fig. 12 supplémentaire). Ces résultats indiquent que la suppression locale optogénétique des neurones Dys réduit les comportements douloureux évoqués par noxH.

Pour étayer cette observation, nous avons photoactivé la fibre thalamocorticale pour activer Dys. Parce que l'on pense que les neurones du noyau postérieur médial (POm) apportent des informations nociceptives du thalamus à S111, nous avons confirmé la connexion des neurones POm à Dys par des traceurs rétro et antérogrades (Fig. 13 supplémentaire) 16 et utilisé des souris avec le virus induit expression de ChR2 (AAV9-hSyn-ChR2(H134R)-EYFP) dans les neurones POm (Fig. 14a supplémentaire)16. En utilisant ces souris, nous avons observé que la photoactivation de Dys en réponse à innH entraînait des profils de vitesse de tapis roulant ressemblant à ceux en réponse à noxH (Fig. 14b supplémentaire). De même, la vitesse maximale avec innH associée à la photoactivation de Dys était presque la même que celle en réponse à noxH (P = 0, 99, Fig. 14c supplémentaire). Des tendances similaires ont été observées pour la direction et la distance de fuite (Fig. 14d, e supplémentaire). Ces résultats montrent que la photoactivation médiée par ChR2 de Dys a amélioré les comportements de type douleur. Chez les souris témoins dépourvues de ChR2 dans POm, la stimulation au laser bleu n'a eu aucun effet (Fig. 14f – j supplémentaires). En résumé, les études optogénétiques démontrent que l'inhibition de Dys réduit les comportements de type douleur, tandis que l'activation de Dys les induit en réponse à innH, révélant le rôle de Dys dans la génération de comportements de type douleur.

Cette étude révèle que Dys montre une sensibilité élevée aux entrées nocives, alors que BF préfère les entrées tactiles. En particulier, les informations nociceptives sont traitées séparément des informations tactiles dans Dys L2/3. Dys est également sensible à la douleur neuropathique. Reflétant la représentation spatialement distincte de la nociception, la suppression optogénétique de l'activité Dys a réduit les comportements nocifs de type douleur évoqués par la chaleur, alors que la même manipulation dans BF n'a montré aucun effet comportemental. Ces résultats indiquent que Dys est impliqué dans la nociception et dans la génération de comportements douloureux.

Des études antérieures ont rapporté que les neurones corticaux nocisensibles sont situés dans les couches plus profondes de BF11,22,23 et Dys24, mais les différences fonctionnelles entre les deux sous-régions restent inconnues. Ici, nous démontrons que Dys et BF ont des rôles distincts dans le traitement nociceptif et tactile, en particulier dans L2/3. Nos données neurophysiologiques montrent en outre que l'entrée de noxH supprime l'activité neuronale dans BF L2/3. Cette suppression peut être la base neurale pour perturber l'acuité de la sensation tactile pendant la douleur30,31.

Contrairement à L2/3, la ségrégation du traitement de l'information nociceptive et tactile était moins claire dans L5b, avec de plus grandes proportions de neurones intégratifs dans les deux régions. Cependant, la préférence pour les stimuli tactiles dans les neurones L5 BF a été maintenue ; Les neurones BF ont montré une préférence plus élevée pour l'entrée tactile que les neurones Dys (Fig. 2c). Étant donné que les neurones L5 sont suggérés pour moduler les entrées nociceptives par la voie corticofuge14,15, les neurones BF L5 pourraient être liés au soulagement de la douleur induite par le toucher dans des conditions normales51, tandis que les neurones Dys L5 pourraient contribuer à l'allodynie mécanique (Fig. 4).

La découverte notable dans la présente étude est que Dys, mais pas BF, est impliqué dans la génération du comportement d'échappement (Fig. 5). Pour un comportement d'évasion approprié, l'animal doit courir dans une direction éloignée de l'entrée nocive (Fig. 5d et Fig. 10a supplémentaire). L'inactivation dys par l'activation optogénétique des interneurones PV locaux a réduit la vitesse d'échappement et perturbé la sélectivité directionnelle pour échapper aux entrées nocives (Fig. 5g et Supplémentaire Fig. 10b). Plusieurs lignes de preuves anatomiques suggèrent que Dys est intimement lié à la fonction motrice et au traitement de la douleur. Dys, par exemple, reçoit des entrées proprioceptives via POm16,20,21 et se projette vers le cortex moteur primaire27. Dys projette également vers le cortex cingulaire antérieur27, qui intègre la douleur sensorielle et affective et module le comportement de type douleur12,13. De plus, Dys a une connexion neuronale avec le cortex somatosensoriel secondaire27, qui est impliqué dans le traitement des informations nociceptives52,53. Il est donc probable que les réseaux neuronaux médiés par Dys favorisent un comportement d'échappement approprié en intégrant le traitement de la proprioception et de la nociception.

La photoactivation des fibres thalamocorticales se projetant de POm vers Dys a induit un comportement d'échappement (Fig. 14 supplémentaire), confirmant les résultats de l'inhibition optogénétique de Dys (Fig. 5). Étant donné que les neurones du POm se projettent vers Dys L4 et BF L516, 54, 55 (Fig. 13b supplémentaire), il peut ne pas être possible d'exclure complètement la contribution de BF. L'activation du BF réduit le comportement de type douleur via l'inhibition par anticipation des axones corticotrigéminaux de L514. De plus, les projections descendantes de Dys se terminent dans des zones distinctes de celles des régions cutanées S1, comme BF56. Compte tenu de ces rapports, dans l'étude actuelle, la photoactivation des fibres POm-S1 qui induisent un comportement douloureux est une conséquence de l'activation des fibres POm-Dys. Ces résultats suggèrent que Dys et BF produisent des effets différents sur les comportements d'évasion et de douleur.

Il a été suggéré que le contrôle de l'activité S1 module les seuils de douleur14,33. Étant donné que la manipulation de l'activité Dys contrôle le comportement de type douleur (Fig. 5), l'inhibition sélective de la région nociréactive dans S1 peut être une cible thérapeutique dans la gestion clinique de la douleur sans affecter les autres fonctions de S1. Les lésions corticales cérébrales en S1 provoquent un soulagement permanent de la douleur (revu dans Whitsel et al57.). Les neurones de la zone 3a des primates non humains, une région dysgranulaire basée sur sa cytoarchitecture57, répondent aux entrées nocives8,57,58 et proprioceptives59. Ces observations et relations phylogénétiques60 suggèrent que la zone 3a du primate est un homologue évolutif du rongeur Dys. De plus, la zone humaine 3a peut jouer un rôle central dans la perception de la douleur61. Ainsi, la zone humaine 3a peut être l'une des cibles idéales d'intervention pour le soulagement de la douleur. Cependant, la zone 3a est enfouie dans le fond d'œil du sillon central chez l'homme62. Par conséquent, l'intervention sélective de la zone 3a est difficile et doit être résolue pour le traitement efficace de la douleur chronique à l'avenir57,58. Néanmoins, nos résultats suggèrent fortement que la région nociceptive distinctive de S1 est une cible thérapeutique potentielle pour le soulagement de la douleur.

Toutes les interventions chirurgicales et les soins postopératoires ont été effectués conformément aux directives du Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de médecine féminine de Tokyo. Toutes les expérimentations animales ont été agréées sous le numéro AE19-109. C57BL/6 N (Sankyo Lab. Service Corp., Tokyo, Japon), PV-Cre (stock JAX #008069) et Ai32 (Rosa-CAG-LSL-ChR2[H134R]-EYFP-WPRE ; stock JAX #012569) des lignées de souris ont été utilisées dans cette étude. Des souris PV-Cre ont été croisées avec des souris Ai32 et la lignée de souris résultante a été désignée PV-ChR2. Des souris mâles âgées de 8 semaines ou plus ont été utilisées. Les animaux ont été logés en groupe dans une cage maintenue à 23 °C ± 1 °C, 50 ± 15 % d'humidité avec un cycle lumière/obscurité de 12 h, et tous les tests comportementaux ont été effectués pendant la période d'obscurité. Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre de souris utilisées et leurs souffrances dans cette étude. Pour les interventions chirurgicales, chaque animal a été anesthésié avec une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (16 mg/kg de poids corporel), et de l'isoflurane a été supplémenté pour maintenir l'anesthésie. La lidocaïne a été appliquée par voie sous-cutanée au niveau du site d'incision et sur les bords de la plaie pour une anesthésie topique. Pour l'imagerie optique du signal intrinsèque, les enregistrements électrophysiologiques et les tests comportementaux sur un tapis roulant sphérique, une plaque frontale sur mesure a été fixée au crâne avec de la résine transparente acrylique dentaire (Super-Bond ; Sun Medical, Shiga, Japon). Les animaux auxquels la plaque de tête a été implantée ont été remis dans leur cage d'origine et ont pu se remettre de la chirurgie pendant au moins 4 jours.

Pour les enregistrements électrophysiologiques de Dys et BF, chaque souris a été anesthésiée avec de l'isoflurane (0,4 à 0,8 %) complété par une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de chlorprothixène (2 mg/kg de poids corporel)63. Étant donné que la réponse nociceptive dépend du niveau d'anesthésie64, la fréquence respiratoire (70 à 120 cycles/s) a été surveillée pour contrôler le niveau d'anesthésie.

Nous avons d'abord identifié la frontière entre Dys et BF selon l'imagerie du signal intrinsèque par stimulation des moustaches (Voir "Imagerie optique du signal intrinsèque"). Ensuite, des électrodes à quatre tiges à 32 canaux (A4x8 ou Buzsaki32; NeuroNexus, Ann Arbor, MI, USA) colorées avec DiI (V22885, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ont été insérées dans Dys et BF. Nous avons simultanément enregistré l'activité neuronale de chaque région avec les champs récepteurs des moustaches de la rangée E. Pour enregistrer les neurones avec des champs récepteurs couvrant les moustaches de la rangée E et le coussinet de moustaches autour de la rangée E65, au moins deux tiges ont été positionnées dans le baril de la rangée E et Dys à côté du baril de la rangée E (Fig. 1a).

Les signaux électriques bruts ont été amplifiés et numérisés à 40 kHz (Plexon, Dallas, TX, USA) puis traités pour le tri des pointes. Le tri des pics comprenait une détection et un regroupement automatisés des pics à l'aide de Klusta (ver. 3.0.16), suivis d'un tri manuel à l'aide de l'interface graphique Kwik (v1.0.9)66. Tout d'abord, les artefacts de bruit déterminés à partir de la forme d'onde ont été extraits. Deuxièmement, l'activité multiunitaire (MUA) a été déterminée à partir de la forme d'onde à faible amplitude et sans période réfractaire (> 2 ms) dans les autocorrélogrammes. Troisièmement, après la fusion et / ou la division des clusters à l'aide d'auto-corrélogrammes et d'auto-corrélogrammes et des caractéristiques des composants principaux, l'activité unitaire (SUA), qui a une période réfractaire claire (> 2 ms) dans les auto-corrélogrammes, ou MUA était déterminé. Pour estimer la profondeur des neurones enregistrés, les amplitudes maximales des formes d'onde de chaque sonde ont été comparées et déterminées pour la sonde la plus proche pour chaque SUA/MUA. Pour l'analyse MUA, SUA a été inclus (n = 8 animaux, 128 sites de sonde enregistrés simultanément pour l'analyse MUA).

Pour l'analyse des données électrophysiologiques du brossage sur le coussinet gauche (Fig. 2 supplémentaire), de la stimulation de von Frey (Fig. 5 supplémentaire) et de la stimulation pendant la ligature ION (Fig. 8 supplémentaire), les signaux électriques bruts ont été amplifiés et numérisés à 30 kHz (Open Ephys67, Open Ephys GUI, v0.5.0) puis traité pour le tri des pointes. Le tri des pointes comprenait la détection et le regroupement automatisés des pointes à l'aide de Kilosort (v2.0, https://github.com/cortex-lab/KiloSort) suivis d'un tri manuel à l'aide de Phy (v2.0b1, https://phy.readthedocs.io/ fr/dernier/). Pour l'analyse MUA à POD7 et POD21 (Fig. 8 supplémentaire), nous avons utilisé la même électrode à 32 canaux et 4 tiges (Buzsaki32) pour chaque enregistrement. Nous avons ensuite sélectionné les deux tiges voisines dans Dys et BF et comparé le nombre total de pointes enregistrées à partir de chaque tige.

Après les enregistrements, les souris ont été profondément anesthésiées avec du pentobarbital sodique (60 mg/kg de poids corporel, par voie intrapéritonéale) et perfusées par voie transcardiaque avec une solution fixatrice (4 % de paraformaldéhyde et 0,2 % d'acide picrique dans un tampon phosphate 0,1 M). Les cerveaux ont été prélevés et coupés coronairement en sections de 50 μm. Les sections ont été incubées pendant une nuit avec un anticorps polyclonal de cobaye contre VGluT2 (cobaye ; 1:500, MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokyo, Japon) suivi de NeuroTrace 435/455 (1:100 ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pour identifier les sites d'enregistrement. Les images ont été capturées avec un microscope droit (AxioScope.A1, Zeiss, Allemagne) avec une caméra CCD refroidie (RS 6.1 s, QSI, Cambridge, Angleterre) avec µManager (ver. 1.4, https://micro-manager.org/ ).

Nous avons calculé le S/N pour identifier la zone ou les propriétés cellulaires et évalué la sélectivité à la chaleur nocive et aux stimuli tactiles. Un dispositif Peltier (4,2 mm × 4,0 mm) a été placé sur le coussinet gauche pour appliquer le stimulus thermique. Pour assurer le transfert de chaleur vers la peau, de minuscules poils entre les moustaches ont été enlevés par une mousse dépilatoire, laissant les moustaches intactes. Pour le S / N de la réponse thermique nocive, la réponse pendant 500 ms à 45–50 ° C pour le dispositif Peltier (ombrage beige, Fig. 1e) a été comptée comme la réponse S. La réponse thermique inoffensive (pendant 1000 ms jusqu'à 45 ° C, correspondant à 33–45 ° C, ombrage gris, Fig. 1e) a été comptée comme la réponse N. Cette définition a aidé à sélectionner les neurones sélectifs à la chaleur nocifs en excluant les neurones codant pour la température.

Pour les stimuli tactiles, la réponse pendant 30 ms après le début de la déviation des moustaches (flèches bleues, Fig. 2a, droite) a été comptée comme la réponse S. La réponse pendant 60 ms jusqu'au début de la déviation des moustaches a été comptée comme la réponse N (Fig. 2a). Toutes les flèches ont été utilisées pour ce calcul (Fig. 2b). Cette définition a permis de détecter comment le neurone réagit à la déviation séquentielle des moustaches68.

Un filament de von Frey (10 g) a été appliqué sur le coussinet de moustache gauche comme stimulus pour la douleur mécanique. Toutes les moustaches et les poils minuscules entre les moustaches sur le coussinet de moustache gauche ont été retirés pour détecter l'application du filament von Frey de 10 g sur la peau. Tous les essais de stimulation ont été surveillés par un enregistrement de caméra à grande vitesse à 200 Hz (XiQ, Ximea GmbH, Münster, Allemagne). La région d'intérêt a été placée sur le coussinet des moustaches et la courbure de la peau a été calculée (graphiques en couleur sur la Fig. 5a supplémentaire). Un point de saturation de flexion de la peau a identifié le début de flexion du filament de von Frey.

La capsaïcine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japon) a été dissoute dans 100 % d'éthanol et 7 % de Tween 80 dans une solution saline (10 mM). Une solution contenant 100 % d'éthanol, 7 % de Tween 80 et une solution saline a été utilisée comme véhicule69. Les animaux ont été transférés dans leurs cages d'origine depuis l'animalerie et anesthésiés avec de l'isoflurane à 2 %. Après l'injection de capsaïcine (50 μL) ou de véhicule (50 μL) dans le coussinet de moustache gauche, les souris ont été replacées dans leurs cages d'origine et renvoyées à l'animalerie.

Trois heures après l'injection, les souris ont été profondément anesthésiées avec de l'isoflurane (2–3 %, 5 min) et perfusées par voie transcardiaque avec une solution préfixative (saccharose 250 mM et MgCl2 5 mM dans une solution saline tamponnée au phosphate 0,02 M, pH 7,4) contenant de l'héparine sodique sel (30 à 40 unités/mL) suivi d'une solution fixatrice (paraformaldéhyde à 4 % et acide picrique à 0,2 % dans une solution tamponnée au phosphate 0,1 M). Les cerveaux ont été postfixés à 4 ° C pendant 12 à 16 h dans un fixateur frais et coupés coronairement en sections de 40 μm d'épaisseur avec un vibratome (VT1000S, Leica Microsystems Inc, Wetzlar, Allemagne). Les coupes ont été incubées à 20–25 °C pendant 12–16 h avec un mélange d'anticorps polyclonal de lapin contre c-Fos (1:2000; 226 003, Synaptic Systems GmbH, Göttingen, Allemagne), un anticorps polyclonal de cobaye contre VGluT2 ( 1:500 ; MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokyo, Japon), un anticorps polyclonal de chèvre contre la calbindine D-28K (1:500 ; MSFR100410, Nittobo Medical Co., Ltd.) et un anticorps monoclonal de souris contre NeuN (1:500 ; MAB377, Merck, Darmstadt, Allemagne) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,05 M contenant 10 % de sérum d'âne normal et 0,3 % de Triton X-100. Après avoir lavé 2 à 3 fois avec du PBS, les coupes ont été incubées à 20–25 ° C pendant 2 à 3 h avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor Plus 555 (pour c-Fos, 1: 500; A32794, Thermo Fisher Scientific, Waltham , MA, États-Unis), Alexa Fluor 647 (pour VGluT2, 1:500 ; 706-605-148, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, États-Unis), Alexa Fluor 488 (pour calbindine, 1:500 ; A11055, Thermo Fisher Scientific ) et Alexa Fluor Plus 405 (pour NeuN, 1:500; A48257, Thermo Fisher Scientific) dans du PBS 0,05 M contenant 10 % de sérum d'âne normal et 0,3 % de Triton X-100. Après avoir lavé 2 à 3 fois avec un tampon phosphate 0,1 M, les coupes ont été montées sur des lames de verre, scellées avec un agent de montage antifade SlowFade Diamond (Thermo Fisher Scientific) et recouvertes d'une lamelle. Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope à fluorescence (BZ-X 810, Keyence, Tokyo, Japon). Le nombre de cellules exprimant c-Fos dans chaque colonne de BF et Dys a été compté manuellement. Le nombre de neurones colorés au NeuN dans les mêmes régions d'intérêt a également été compté. Le comptage manuel a été effectué par un observateur indépendant en aveugle.

Une fois les cerveaux postfixés, des tranches de 50 μm d'épaisseur ont été préparées et des tranches alternées ont été mises à réagir avec la cytochrome c oxydase pour identifier BF et avec l'immunohistochimie c-Fos. Pour l'immunohistochimie c-Fos, les tranches ont été traitées avec 1 % de H2O2 dans un tampon phosphate pour désactiver la peroxydase intrinsèque, puis incubées avec un anticorps anti-c-Fos (1:10000, lapin ; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) dans 10 % d'échantillons normaux sérum de chèvre dans une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,3 % de Triton X-100 à 4 oC pendant la nuit. Les tranches ont ensuite été incubées avec un anticorps IgG de chèvre anti-lapin biotinylé (1: 200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) et mises à réagir avec un complexe avidine-biotine-peroxydase (kit ABC; Vector Laboratories). Les tranches ont été incubées dans une solution DAB (0,02 % de DAB, 0,3 % de sulfate de nickel et d'ammonium dans une solution saline tamponnée au Tris) et 1 % de H2O2 pour la visualisation. Les images ont été acquises avec un microscope droit avec une caméra CCD (DP70; Olympus, Tokyo, Japon) en utilisant Olympus DP Manager (ver. 3.1.1.208, Olympus). Les neurones exprimant c-Fos ont été comptés à l'aide d'un programme MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) écrit sur mesure (logiciel supplémentaire 1) avec détection des bords par un filtre Sobel suivi d'une binarisation. Le nombre de cellules exprimant c-Fos a été compté manuellement en trois tranches par un observateur indépendant en aveugle ; cet individu n'a pas été impliqué dans le comptage automatique et a confirmé que la tendance de l'expression de c-Fos dans chaque couche ne différait pas d'une région à l'autre.

Pour le marquage rétrograde, la sous-unité B de la toxine cholérique conjuguée à Alexa Fluor 555 (0,2 %) ou Alexa Fluor 488 (1 %) a été appliquée après imagerie du signal intrinsèque pour identifier respectivement Dys et BF. Trois jours plus tard, les souris ont été profondément anesthésiées avec du pentobarbital sodique (60 mg/kg de poids corporel, par voie intrapéritonéale) et perfusées par voie transcardiaque avec une solution fixatrice (paraformaldéhyde 4 % et acide picrique 0,2 % dans un tampon phosphate 0,1 M). Les cerveaux ont été prélevés et coupés coronairement en sections de 50 μm. Les sections ont été incubées pendant une nuit avec un anticorps polyclonal de cobaye contre VGluT2 (1:500 ; MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokyo, Japon) suivi de NeuroTrace 435/455 (1:100 ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ETATS-UNIS).

Pour le marquage antérograde, de l'amine de dextran biotinylée (poids moléculaire : 10 000, 10 % dans une solution saline ; Thermo Fisher Scientific) a été injectée dans le POm (1,7 mm en arrière du bregma et 1,3 mm en dehors de la ligne médiane). Sept jours plus tard, les souris ont été profondément anesthésiées et les coupes de cerveau ont été coupées comme décrit ci-dessus. Les sections ont été incubées pendant une nuit avec l'anticorps VGluT2 (cobaye ; 1:500, MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokyo, Japon) suivi d'un anticorps anti-cobaye conjugué à Alexa Fluor 594 (1:500 ; 706-585- 148, Jackson ImmunoResearch), streptavidine conjuguée à Alexa Fluor 488 (1:500; S11223, Thermo Fisher Scientific), puis avec NeuroTrace 435/455 (1:100; S21479, Thermo Fisher Scientific).

Au moins 4 jours après l'implantation de la plaque de tête, une imagerie du signal intrinsèque a été réalisée pour mesurer les réponses de BF. La souris a été anesthésiée comme décrit ci-dessus dans "Enregistrement électrophysiologique". La fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque ont été surveillées via un moniteur de respiration vidéo avec une caméra Web de 30 Hz (C920; Logitech, Lausanne, Suisse) et un moniteur d'accélération sur mesure sur le dos de l'animal. Les images de signal intrinsèque ont été obtenues à l'aide du logiciel microDisplay (ver. 5.2.3.1, Silicon Software GmbH, Allemagne) par une caméra CMOS (MV1-D1024E-160-CL; Photonfocus, Lachen, Suisse) avec la lentille tandem d'un doublet achromatique (Thorlabs , Newton, NJ, USA) et des filtres passe-haut et passe-bas (BLP01-488R-25 et FF01-650/SP-25 ; Semrock, Rochester, NY, USA). Les images ont été acquises à une fréquence de 20 Hz, et la taille de l'image était de 600 × 500 pixels et représentait 5,5 × 4,5 mm de la zone corticale. La surface du cerveau a été éclairée par une LED verte (M530L3 ; Thorlabs) pour obtenir le motif du vaisseau ou une LED rouge (M617L3 ; Thorlabs) pour obtenir le signal intrinsèque. La luminance de la LED rouge était constante entre chaque imagerie. La fréquence respiratoire (70 à 120 cycles/s) a été surveillée pour suivre la profondeur de l'anesthésie. Les images ont été enregistrées à travers le crâne recouvert de résine transparente acrylique dentaire. La résine acrylique dentaire a été recouverte d'une couche de finition pour les ongles et d'huile de silicone à immersion (Olympus) pour réduire l'éblouissement.

Des stimulations de moustaches en tant que stimuli tactiles ont été générées à l'aide d'un dispositif piézoélectrique tel que décrit précédemment68. Pour visualiser la réponse corticale aux stimuli tactiles, nous avons calculé le rapport de réflectance dans chaque image (dR/R, où dR est la différence de réflectance R de l'image de base qui est la moyenne de 20 images prises avant le début du stimulus). Pour cartographier le changement d'activité corticale, les images prises à différents jours expérimentaux ont été alignées en fonction des modèles de vaisseaux à l'aide d'un programme MATLAB personnalisé. Pour l'analyse de la population, nous avons calculé l'image z-scorée à partir de dR/R en utilisant l'équation suivante :

où SD est l'écart type. Les positions du bregma ont été utilisées pour l'alignement entre les animaux.

Pour produire un modèle de douleur neuropathique, l'ION a été étroitement ligaturé par un fil chirurgical (Vicryl Rapide ; Ethicon, Bridgewater, NJ, États-Unis). Ce fil nous permet d'observer les changements dans l'activité du BF pendant la lésion nerveuse et la récupération, car la résistance à la traction du fil diminue progressivement à l'intérieur du corps (en 2 à 3 semaines) ; la résistance à la traction est réduite à près de 50 % à POD7 et 0 % à POD21, correspondant respectivement aux phases de lésion nerveuse et de récupération. Pour le test comportemental de la douleur neuropathique, les animaux ont été entraînés à entrer dans un tube de 50 ml avec un porte-tube sur mesure. L'entraînement comportemental a commencé après que les souris aient eu un accès restreint à l'eau (1 mL/jour) au moins 7 jours avant la ligature ION gauche ou l'opération fictive. L'eau a été limitée à 1,5 ml pendant 1 jour au cours de l'expérience comportementale. Les animaux ont été entraînés à entrer dans le tube et à garder leur museau dépassant à travers un trou pour boire l'eau. Pendant que les animaux buvaient, le coussinet gauche des moustaches était stimulé par les filaments de von Frey (1,4, 2, 4, 6, 8 et 10 g ; Ugo Basile, Varèse, Italie) pour mesurer le seuil d'échappement70. Pendant la stimulation, les informations visuelles étaient bloquées par une couverture noire (Fig. 6 supplémentaire).

7 ou 21 jours après la ligature ION et 7 jours après l'opération simulée, les souris ont été placées dans un environnement enrichi pendant 1 h pour augmenter le fouettement pendant qu'elles exploraient plusieurs objets (Fig. 9 supplémentaire) 40,41. Ensuite, les souris ont été perfusées avec du paraformaldéhyde à 4% avec de l'acide picrique suivi d'une immunohistochimie c-Fos en utilisant le protocole DAB décrit ci-dessus.

Les souris ont d'abord été entraînées à entrer dans un tube pour obtenir une récompense en eau pendant 3 à 4 jours. Les souris ont ensuite été fixées sur la tête et libres de courir sur un tapis roulant sphérique (Ø 30 cm) sous bruit blanc71 pendant 3 à 4 jours. Après cela, les comportements des souris envers le stimulus laser IR sur le coussinet gauche ont été surveillés. Pour le stimulus thermique nocif, un laser à diode IR (Ø 1 mm sur le coussinet des moustaches, longueur d'onde de 808 nm, SSL-808-1000-10TM-D-LED ; Shanghai Sanctity Laser Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine) a été utilisé. La durée du stimulus a été fixée à 500 ou 1 500 ms, correspondant respectivement à 0,09 et 0,27 J/mm2, pour augmenter la température cutanée à 39 °C ou 52 °C43. Au début et à la fin de chaque séance, les animaux obtenaient une récompense en eau sur le tapis roulant mais pas pendant les séances de stimulation. Chaque session était composée de diverses conditions de stimulation, et chaque condition a été choisie au hasard et présentée à l'animal cinq fois en une session. Les animaux ont été imagés avec trois caméras à 30 Hz (le filtre IR du capteur CMOS a été retiré ; C922, Logitech, Lausanne, Suisse) placés derrière et de chaque côté de l'animal pour enregistrer des comportements tels que la direction de fuite, la vitesse, la distance de déplacement , clignement des yeux et mouvement du membre antérieur gauche. Ces paramètres ont été analysés en calculant la différence de la région d'intérêt de chaque paramètre image par image. Ces paramètres ont été calculés en scores z pour les comparaisons entre les animaux par un code MATLAB personnalisé (logiciel supplémentaire 2). Si l'animal courait continuellement sur le tapis roulant avant le début du stimulus, l'effet du stimulus était masqué. Ces animaux avaient tendance à courir en continu quels que soient les stimuli. Par conséquent, aucune différence dans la vitesse maximale entre les essais n'a pu être observée, et ces sessions ont été exclues de l'analyse. Au moins deux sessions ont été utilisées pour calculer les scores z. Un filtre coupe-bande (filtre coupe-bande 808 nm OD4, 86-702; Edmund Optics) a été placé devant la caméra du côté gauche pour empêcher le blanc du capteur et pour identifier la position et la taille précises de la stimulation laser IR. Des illuminateurs LED sur mesure (940 nm) ont été placés devant chaque caméra pour éclairer les animaux.

Pour activer les fibres thalamocorticales de POm dans Dys, un virus (AAV9-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP) a été injecté dans le POm droit (1,7–1,9 mm caudal et 1,2 mm latéral au bregma ; profondeur, 2800 et 3000 μm de la surface du cerveau ; 50 nL à chaque profondeur) (QSI ; Stoelting, Wood Dale, IL, États-Unis). Un laser bleu (473 nm ; Lasos, Allemagne) a été couplé à un câble à fibre optique (Ø 200 μm ; Thorlabs). La sortie de la fibre optique et la surface du cortex ont été placées sur des plans conjugués à l'aide d'un port de fibre et d'une lentille achromatique. Les miroirs Galvano x et y (système de balayage Galvano, GVS002; Thorlabs) ont été placés dans l'espace infini pour contrôler la position du stimulus. Un miroir dichroïque a également été placé dans l'espace infini et la lumière réfléchie a été focalisée sur le capteur d'une caméra CMOS (Grasshopper3 ; Teledyne FLIR, Oregon). Cette conception a permis de suivre la localisation précise du site stimulé49.

Un hacheur optique (largeur d'impulsion, 2,5 ms, MC2000B ; Thorlabs) a été utilisé pour activer les interneurones PV avec une impulsion de 40 Hz72. Pour étudier l'effet suppresseur de l'activité Dys, les six positions couvrant Dys ont été stimulées par un laser à 473 nm focalisé sur la surface du cerveau par une lentille doublet achromatique (AC254-60-A; Thorlabs). Les centres des sites de stimulation étaient distants de 430 µm. La puissance était de 0,9 mW par emplacement, et le rayon était de 0,5 à 0,75 mm, résultant en 0,51 à 1,15 mW/mm2, avec une atténuation de la lumière à travers le crâne50. Les positions laser aux deux extrémités, la position 1 (P1) et P6, étaient bien éloignées de Dys, tandis que P3 et P4 étaient centrées sur Dys. Compte tenu de la taille de la tache lumineuse, P3 et P4 peuvent partiellement stimuler les régions voisines de patte et BF.

Les statistiques ont été réalisées à l'aide de MATLAB (R2018a, 9.4.0.813654). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM, sauf indication contraire. Les coupes coronales représentatives illustrées à la Fig. 1a, Figs supplémentaires. 1b, 9b, 13a, b et 14a, et les sections tangentielles représentatives illustrées à la Fig. 4c et à la Fig. 7 supplémentaire ont été répétées indépendamment avec des résultats similaires au moins trois fois ou avec le même nombre d'animaux indiqués dans chaque expérience.

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Nous remercions Sachie Sekino et Yumi Tani pour leur excellente assistance technique. Cette recherche a été soutenue par les numéros de subvention JSPS KAKENHI JP15K21387, JP17H05912, JP18K14854, JP21K07285 et la Uehara Memorial Foundation to HO 5752, JP15H01667, et le Fonds de bourses d'études SHISEIKAI pour Chercheur fondamental en sciences médicales, prix Keiko Watanabe aux numéros de subvention MM et JSPS KAKENHI JP21K06444 à YU et au programme de cartographie cérébrale par neurotechnologies intégrées pour les études sur les maladies (Brain / MINDS) de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux, AMED, sous subvention numéro JP19dm0207057.

Hironobu Osaki

Adresse actuelle : Laboratoire de construction de circuits cérébraux fonctionnels, École supérieure des sciences du cerveau, Université Doshisha, Kyotanabe, Kyoto, Japon

Division de neurophysiologie, Département de physiologie, École supérieure de médecine, Université de médecine féminine de Tokyo, Shinjuku, Tokyo, Japon

Hironobu Osaki, Moeko Kanaya, Yoshifumi Ueta et Mariko Miyata

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HO et MM ont conçu les expériences. HO, MK et YU ont réalisé les expériences et analysé les données. HO et MM ont rédigé le projet original.

Correspondance à Hironobu Osaki ou Mariko Miyata.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Jochen Staiger, Oleg Favorov et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Osaki, H., Kanaya, M., Ueta, Y. et al. Traitement distinct de la nociception dans les régions dysgranulaires et cylindriques du cortex somatosensoriel de la souris. Nat Commun 13, 3622 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31272-w

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Reçu : 25 mars 2021

Accepté : 07 juin 2022

Publié: 29 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-31272-w

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