Tomographie optoacoustique multiplexée en longueur d'onde de fréquence

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4448 (2022) Citer cet article

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L'optoacoustique (OA) est massivement mise en œuvre dans le domaine temporel (TD) pour obtenir des rapports signal sur bruit élevés en maximisant le transitoire d'énergie lumineuse d'excitation. Des implémentations dans le domaine fréquentiel (FD) ont été proposées, mais souffrent de faibles rapports signal sur bruit et n'ont pas offert d'avantages concurrentiels par rapport aux méthodes dans le domaine temporel pour atteindre une diffusion élevée. Il est donc communément admis que TD est le moyen optimal d'effectuer l'optoacoustique. Ici, nous introduisons un concept optoacoustique basé sur l'éclairage par train d'impulsions et le multiplexage dans le domaine fréquentiel et démontrons théoriquement les mérites supérieurs de l'approche par rapport au domaine temporel. Ensuite, en utilisant les progrès récents de l'éclairage par diode laser, nous lançons la tomographie optoacoustique à multiplexage en longueur d'onde de fréquence (FWMOT), à plusieurs longueurs d'onde, et montrons expérimentalement comment le FWMOT optimise les rapports signal/bruit des mesures spectrales sur les méthodes du domaine temporel dans les fantômes et dans vivo. Nous constatons en outre que FWMOT offre le fonctionnement multispectral le plus rapide jamais démontré en optoacoustique.

La génération de signaux optoacoustiques (OA) nécessite l'éclairage de l'échantillon avec des transitoires d'énergie (par exemple, un éclairage pulsé ou sinusoïdal)1. L'échantillon absorbe cette énergie variable dans le temps et génère ensuite une onde acoustique par expansion thermo-élastique2. Les implémentations OA dans le domaine temporel (TD) offrent des transitoires d'énergie importants au moyen d'impulsions lumineuses de durée nanoseconde3,4,5,6, afin de satisfaire les limites de confinement thermique et de contrainte nécessaires à la génération de signaux optoacoustiques7. Une impulsion de durée nanoseconde maximise également le transitoire d'énergie et optimise le rapport signal sur bruit (SNR), faisant ainsi de TD le domaine de choix en optoacoustique8,9,10. L'imagerie optoacoustique TD enregistre le temps de vol des ondes ultrasonores générées (US) à plusieurs endroits sur la surface de l'objet interrogé au moyen d'un transducteur ultrasonore sensible et, à l'aide d'une inversion mathématique, convertit ces mesures en cartes tridimensionnelles de absorption optique11.

D'autres modalités d'imagerie telles que la tomographie par cohérence optique (OCT) ou l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ont été initialement démontrées dans le TD, mais ont bénéficié, en termes de vitesse d'imagerie et de SNR, de l'opération de commutation vers le domaine de fréquence (FD)12,13 . L'optoacoustique du domaine fréquentiel (FD) a également été considérée comme une alternative au TD, en modulant l'intensité d'éclairage à une fréquence discrète et en détectant les signaux OA générés à la même fréquence14,15,16. La détection du signal est réalisée avec des techniques de démodulation qui récupèrent l'amplitude et la phase du signal OA, une technologie qui est plus simple et plus économique que l'enregistrement de signaux temporels à des taux d'échantillonnage de dizaines de MHz, comme c'est courant dans la détection TD. La FD peut également permettre un éclairage simultané à plusieurs longueurs d'onde, en modulant des sources de différentes couleurs à différentes fréquences17,18,19. Malgré ces avantages, la lumière modulée en intensité14,15,16 fournit des transitoires d'énergie et des signaux optoacoustiques correspondants qui sont aussi faibles que six ordres de grandeur19 plus faibles que les impulsions ultracourtes utilisées dans TD, réduisant considérablement le SNR dans le FD20,21,22. De plus, les investigations optoacoustiques à une seule fréquence ne parviennent pas à collecter des informations de profondeur ou à conduire à une imagerie tridimensionnelle. Nous avons récemment montré23 que les informations de profondeur et la reconstruction d'images tridimensionnelles nécessitent la génération de signaux à plusieurs fréquences discrètes, une exigence qui conduit à des schémas complexes d'émission (modulation) et de détection (démodulation)23,24. Par conséquent, malgré les avantages potentiels par rapport au TD17,18,19,23,24, FD a eu peu d'impact dans le domaine de l'optoacoustique. Le chirp de fréquence a également été étudié en tant que méthode hybride TD-FD, en modulant la lumière à une fréquence variant en continu17,25, codant ainsi le temps en fréquence. La détection est effectuée dans le TD en utilisant des techniques de corrélation temporelle. Semblable aux méthodes FD, cependant, l'utilisation d'ondes sinusoïdales limite le SNR obtenu, limitant l'utilisation d'approches chirp aux investigations expérimentales.

Ici, nous proposons un fonctionnement multiplexé en longueur d'onde de fréquence (FWM) pour améliorer catégoriquement les performances TD, tout en minimisant les inconvénients FD. FWM est en fait la mise en œuvre inverse de l'optoacoustique chirp, utilisant un train d'impulsions discrètes, similaires à celles utilisées dans l'optoacoustique TD, mais traitant les fréquences discrètes résultantes qui apparaissent dans le FD23, une réponse analogue à l'apparence du peigne de fréquence vue dans fréquences spectrales. Comme indiqué ici, l'éclairage FWM permet également un éclairage simultané à plusieurs longueurs d'onde sans augmenter le temps d'imagerie et sans produire un gain SNR qui augmente de la racine carrée du nombre de longueurs d'onde N utilisées, sur les systèmes TD. Suite à des considérations théoriques, nous avons émis l'hypothèse que les diodes laser surexcitées26, qui offrent une alternative moins chère et plus pratique aux lasers à semi-conducteurs, pourraient exploiter les trains d'impulsions FWM et conduire à une imagerie optoacoustique de haute qualité qui pourrait démontrer des avantages par rapport aux implémentations TD. Nous introduisons un système de tomographie optoacoustique multiplexé en longueur d'onde de fréquence (FWMOT) qui utilise 4 diodes laser suralimentées à impulsions simultanées, chacune utilisant un taux de répétition légèrement différent afin de coder différentes longueurs d'onde. Ces longueurs d'onde apparaissent alors à différentes fréquences discrètes dans le domaine fréquentiel. Nous montrons une imagerie mésoscopique27 multi-longueur d'onde simultanée de la dynamique lymphatique et microvasculaire chez la souris à des SNR élevés, offrant l'éclairage multi-longueur d'onde le plus rapide jamais réalisé dans le domaine de l'optoacoustique et confirmant les performances spectrales qui améliorent les implémentations TD.

En fonctionnement TD classique, une impulsion lumineuse carrée de durée tp (Fig. 1a) produit un spectre de fréquence continu dans le FD, via la transformée de Fourier, avec le premier nœud à la fréquence 1/tp. En fonctionnement FD, la lumière modulée par une onde sinusoïdale dans le TD (Fig. 1b) produit une seule fréquence discrète dans le FD. La modulation multiplexée en longueur d'onde de fréquence considère plutôt un train d'impulsions (Fig. 1c) avec une largeur d'impulsion de tp et un taux de répétition frep. La transformée de Fourier de ce train d'impulsions produit de nombreuses fréquences discrètes avec une enveloppe (Fig. 1c, à droite) identique au spectre continu d'une seule impulsion de durée tp (Fig. 1a, à droite). Les fréquences discrètes du train d'impulsions sont des harmoniques du taux de répétition fondamental, frep, c'est-à-dire des multiples entiers de frep. Un taux de répétition plus élevé augmente le nombre d'impulsions dans le TD et réduit les pics discrets dans le FD (Fig. 1d). Dans le FD, une largeur d'impulsion plus longue fait apparaître le premier nœud (à 1/tp) à des fréquences plus basses (Fig. 1e), réduit la densité d'énergie globale à des fréquences plus élevées et diminue la résolution spatiale28.

a Une seule impulsion lumineuse d'excitation de durée tp en TD (à gauche) et un spectre continu de fréquences en FD (à droite). b Une onde sinusoïdale de fréquence f en TD et FD, une onde continue en TD et un seul pic discret en FD. c Un train d'impulsions de durée d'impulsion tp et de fréquence de répétition frep en TD et FD. De nombreuses impulsions discrètes en TD et de nombreuses fréquences discrètes en FD avec la même enveloppe qu'une seule impulsion de durée tp en a. d Un train d'impulsions avec une durée d'impulsion tp et un taux de répétition 2frep en TD et FD. Deux fois plus d'impulsions en TD mais la moitié du nombre de fréquences discrètes en FD par rapport à c. e Un train d'impulsions avec une durée d'impulsion 2tp et un taux de répétition 2frep en TD et FD. Autant d'impulsions en TD et de fréquences discrètes en FD qu'en d mais suivant maintenant une enveloppe différente de (a) ou (c). f Le signal optoacoustique brut enregistré à l'aide d'un train d'impulsions comme (c) par exemple avec 1, 2, 3 et … indiquant les différentes périodes. g, h présentent la moyenne normale en TD. g Le train d'impulsions est découpé en tranches de période T = 1/frep, indiquées par 1, 2, 3 et … dont on fait la moyenne (h) point par point. i, j Le traitement multiplexé en longueur d'onde de fréquence du même signal. i La transformée de Fourier du signal optoacoustique brut (f) à plusieurs fréquences discrètes qui sont toutes des harmoniques (k * frep avec k entier positif) du taux de répétition de base frep. Dans FD, nous choisissons uniquement les harmoniques de frep et éliminons toutes les autres fréquences qui ne contiennent que du bruit (j). k En effectuant la Transformée de Fourier inverse en j on récupère le signal TD qui correspond parfaitement à celui en h.

La validation expérimentale du schéma FWM a été réalisée en excitant une couche de vernis noir sur une boîte de Pétri en utilisant uniquement L1 (Fig. 1f, g). La moyenne en TD (Fig. 1g, h) augmente le SNR d'un facteur \(\scriptstyle{\sqrt{{N}_{{{{{\rm{p}}}}}}}\), où Np est le nombre d'impulsions dans le train d'impulsions. En revanche, la méthode FWM proposée sélectionne la fréquence fondamentale frep et ses harmoniques, k * frep, k étant un entier, (Fig. 1i) en effectuant l'opération suivante (voir la note complémentaire 1) :

où Sa (ω) est la transformée de Fourier du signal moyen, Sr (ω) la transformée de Fourier du signal enregistré (Fig. 1f), Nh le nombre d'harmoniques dans la bande passante détectée du transducteur à ultrasons et ω0 = 2π/T. Le signal OA est généré exactement aux mêmes fréquences que celles contenues dans le train d'impulsions d'excitation LD. Par conséquent, l'opération (1) sélectionne uniquement les harmoniques de frep et filtre les fréquences qui ne contiennent pas de signal pour augmenter le SNR du même facteur \(\scriptstyle{\sqrt{{N}_{{{{{\rm{p }}}}}}}}\) comme dans le TD (Fig. 1j). Le signal de la Fig. 1j est la transformée de Fourier du signal de la Fig. 1h, les deux signaux correspondant parfaitement (Fig. 1k). Cette analyse confirme que l'éclairage FWM se traduit par une génération pratique de plusieurs fréquences discrètes, nécessaires pour un fonctionnement FD précis, offrant un SNR équivalent au TD lorsqu'une seule longueur d'onde est utilisée. L'analyse FWM est donc l'espace de Fourier équivalent à la moyenne temporelle normale. Ensuite, nous montrons cependant que FWM offre des avantages par rapport à TD lorsque plusieurs longueurs d'onde sont utilisées.

Pour démontrer l'avantage du FWM par rapport au TD (Fig. 2), nous avons tracé le modèle d'excitation à une seule longueur d'onde dans le TD et son spectre de puissance dans l'espace de Fourier (Fig. 2a) pour servir de référence pour l'analyse qui suit. Le train d'impulsions représenté a une période T qui correspond à un taux de répétition frep = 1/T, un nombre total d'impulsions Np, une largeur d'impulsion tp et un temps d'acquisition tacq = Np × T. La période T définit la profondeur maximale de -voir DoV = vs × T pouvant être atteint pour le train d'impulsions sélectionné, où vs est la vitesse du son.

a Un train d'impulsions d'une longueur d'onde de période T et de fréquence de répétition frep = 1/T, avec Np impulsions et temps d'acquisition tacq dans le domaine temporel (TD, à gauche) et dans le domaine de Fourier (à droite), avec k frep les harmoniques de frep avec k un nombre entier. b – d Excitation à plusieurs longueurs d'onde dans TD Optoacoustic (OA). b Le diagramme d'excitation de 4 longueurs d'onde émettant au même rythme de répétition frep avec un décalage temporel T/4, Np impulsions pour toutes les longueurs d'onde et temps d'acquisition tacq. c Le schéma d'excitation de 4 longueurs d'onde avec fréquence de répétition frep/4, Np/4 impulsions pour chaque longueur d'onde et temps d'acquisition tacq. d Le schéma d'excitation de quatre longueurs d'onde avec un taux de répétition frep/4, Np impulsions par longueur d'onde mais avec un temps d'acquisition de 4tacq. e Excitation FWMOT où les quatre longueurs d'onde ont des taux de répétition différents frep,1, frep,2, frep,3, frep,4, Np impulsions pour chaque longueur d'onde et temps d'acquisition tacq. f – j Le signal OA enregistré par une couche de vernis noir sur une boîte de Pétri à partir des motifs d'excitation en (a – e) respectivement. Le rapport signal sur bruit (SNR) et le niveau de bruit sont indiqués pour tous les cas. f α, l'interférence électromagnétique du circuit de la diode laser lorsqu'elle est déclenchée, β le signal OA du vernis noir, γ la réflexion du signal OA dans la boîte de Pétri ou dans la lentille acoustique du transducteur à ultrasons. g Le signal OA du modèle d'excitation b pour toutes les longueurs d'onde (ligne du haut) est la somme du signal OA de chaque longueur d'onde (ligne du bas), avec une profondeur de vue (DoV) considérablement réduite pour chaque longueur d'onde. L'interférence laser, le signal OA et ses réflexions (α, β, γ) pour chaque longueur d'onde sont indiqués. h Le signal OA à chaque longueur d'onde a un SNR réduit. i Le signal OA a le même SNR mais avec un temps d'acquisition accru. j Le signal des quatre longueurs d'onde a été récupéré sans aucune diaphonie entre les lasers et correctement co-enregistré dans le temps sans compromettre le DoV, le SNR ou le temps d'acquisition. Le bleu, le rouge, l'orange, le violet et le vert sont utilisés pour indiquer respectivement le laser 1, le laser 2, le laser 3 et le laser 4.

Le multiplexage de longueur d'onde TD est effectué à l'aide d'un entrelacement de longueur d'onde ou d'un partage de temps. Cependant, lors de l'augmentation du nombre de longueurs d'onde dans le TD, au moins l'un des trois paramètres suivants doit être compromis : le DoV, le nombre d'impulsions dans le train d'impulsions et donc le SNR pour chaque longueur d'onde, ou le temps d'acquisition total. La figure 2b montre comment le DoV est réduit lors de l'utilisation de quatre longueurs d'onde à un temps d'acquisition total donné. Les différentes longueurs d'onde excitent le tissu en utilisant le même taux de répétition frep mais avec un décalage temporel tsh entre chaque longueur d'onde (Fig. 2a), donné par tsh = T/N, où N est le nombre de longueurs d'onde. Le résultat est une réduction du temps entre les impulsions suivantes, limitant le DoV disponible pour chaque longueur d'onde par un facteur N. Alternativement, il est possible de conserver le DoV d'origine en abaissant le taux de répétition pour chaque longueur d'onde, j, à frep,j = frep/N et le nombre d'impulsions par longueur d'onde à Np/N (Fig. 2c) ; cependant, cette approche entraîne une réduction du SNR d'un facteur \ (\ sqrt {N}. \) Une troisième alternative conserve le DoV et le SNR d'origine tout en prolongeant le temps d'acquisition d'un facteur N (Fig. 2d).

Contrairement à TD, FWMOT utilise un petit décalage de fréquence δf pour le taux de répétition de chaque longueur d'onde (Fig. 2e; temps), de sorte que δf << frep. Chaque longueur d'onde a un taux de répétition différent, ce qui se traduit par un DoV effectif légèrement différent ; cependant, puisque δf << frep, cette différence est non significative. Le spectre de puissance du modèle d'excitation FWMOT (Fig. 2e; à droite) montre l'apparition d'harmoniques à partir du taux de répétition fondamental pour chaque longueur d'onde. Le taux de répétition du premier laser, frep,1, peut être sélectionné comme taux de répétition de référence, le taux de répétition des lasers restants étant donné par frep,j = frep,1 + (j − 1) * δf. FWMOT récupère ainsi les signaux OA en évaluant Eq. (1) avec le ω0 = 2πfrep,j correspondant pour chaque longueur d'onde. Par conséquent, en utilisant la séparation des fréquences, le FWMOT peut multiplexer différentes longueurs d'onde sans compromettre le DoV, le SNR ou le temps d'acquisition. Avec le signal traité dans le FD, la résolution en fréquence est définie par df = 1/tacq, où tacq = Np/frep,1, ce qui signifie que les fréquences qui diffèrent de moins de df ne peuvent pas être résolues. Afin de récupérer le signal OA de toutes les longueurs d'onde, toutes les harmoniques de tous les lasers qui se trouvent dans la bande passante de détection du transducteur à ultrasons (UST) doivent donc être espacées à une distance supérieure à la résolution de fréquence df, imposant un nombre minimum d'impulsions Np,min qui dépend des limites de bande passante UST (flux et fhigh), N et frep,1 (voir la note complémentaire 2). Les paramètres N, débit, fhigh, frep,1 et le nombre d'impulsions choisi, Np, définissent la plage de petits décalages de fréquence (δf), entre δfmin et δfmax, nécessaires pour récupérer le signal de chaque longueur d'onde sans pertes. Une valeur δf supérieure à δfmin garantit que les harmoniques des lasers j et j + 1, qui se situent à l'extrémité inférieure de la bande passante UST, sont bien résolues, tandis qu'une valeur δf inférieure à δfmax garantit que les harmoniques des laser 1 et N, qui se situent à l'extrémité supérieure de la bande passante UST, sont bien résolus.

Pour démontrer expérimentalement les avantages du fonctionnement FWM dans l'excitation à plusieurs longueurs d'onde par rapport à l'optoacoustique TD, nous avons utilisé FWMOT avec les quatre longueurs d'onde. Le signal optoacoustique résultant à la longueur d'onde 1, frep, 1 = 200 kHz et Np = 200 est présenté sur la figure 2f et atteint tacq = 1 ms et DoV = 7, 5 mm. Les interférences électromagnétiques provenant du circuit de commande de la diode laser (LD) sont indiquées par α. Le signal OA primaire généré à partir du vernis noir sur une boîte de Pétri est indiqué par β, les réflexions de la lentille en verre UST qui arrivent plus tard dans le temps étant indiquées par γ. L'encart "Niveau de bruit" montre une mesure séparée du niveau de bruit qui a donné un écart type de 90,6 μV. L'intensité du signal OA de LD1 a été mesurée à 12 mV, résultant en un SNR de 21,2 dB.

La figure 2g présente le signal OA moyenné dans le TD, lorsque le DoV est compromis. Chaque LD a frep,j = 200 KHz, Np = 200 et un décalage temporel entre eux qui se traduit par DoV = 1,875 mm et tacq = 1 ms. Le signal OA résultant de l'excitation simultanée utilisant le motif de la Fig. 2b est présenté sous la forme d'une ligne verte et correspond à la somme des signaux OA individuels obtenus lorsque chaque longueur d'onde a été pulsée séparément (Fig. 2g). Nous pourrions facilement détecter l'interférence du déclenchement laser pour toutes les longueurs d'onde (α). Les signaux OA des longueurs d'onde 1 et 2 (β) sont situés très près de l'interférence laser (α) des longueurs d'onde 3 et 4 respectivement, réduisant considérablement leur SNR (5,7 dB pour la longueur d'onde 1). Cependant, le signal OA de longueur d'onde 3 est complètement masqué par l'interférence de longueur d'onde 1. Les réflexions du signal OA de longueur d'onde 1, 2 et 3 (γ) sont toujours visibles. Par conséquent, les interférences électromagnétiques et les réflexions OA limitent davantage le DoV et le SNR obtenus dans l'optoacoustique TD à plusieurs longueurs d'onde.

De même, des limites SNR sont imposées (Fig. 2h) en réponse à un modèle d'excitation (Fig. 2c) qui utilise frep,j = 50 kHz, Np = 50 et DoV = 7,5 mm pour chaque longueur d'onde avec tacq = 1 ms. Pour toutes les longueurs d'onde, nous avons observé que l'interférence laser (α), le signal OA (β) et les réflexions (γ) sont tous visibles mais avec un SNR plus faible. Dans ce cas, l'écart type de bruit (présenté dans les encarts de la figure) était de 161,6 μV, ce qui est supérieur aux 90,6 μV mesurés dans le train d'impulsions avec 200 impulsions en moyenne (Fig. 2f), tandis que l'intensité du signal est restée 12 mV résultant dans un SNR de 18,8 dB pour la longueur d'onde 1. Enfin, avec frep,j = 50 kHz, Np = 200 et DoV = 7,5 mm pour chaque laser, le signal OA des 4 lasers peut être enregistré sans pertes de SNR (N = 90,6 μV et S = 12 mV avec 21,2 dB pour la longueur d'onde 1) mais avec un temps d'acquisition plus long, tacq = 4ms, qui est présenté sur la Fig. 2i.

Inversement, le fonctionnement FWMOT pour quatre longueurs d'onde utilise frep,1 = 200 kHz, δf = 125 Hz et Np = 200 et récupère chaque signal sans diaphonie entre les longueurs d'onde (Fig. 2j), confirmant expérimentalement les prédictions théoriques. Fig. supplémentaires. 4 et 5 présentent la série temporelle d'excitation de la diode laser, la série temporelle de signal OA correspondante et les spectres de puissance des deux, afin de mieux présenter le fonctionnement de FWMOT et de vérifier la capacité de la méthode à récupérer chaque signal sans diaphonie (voir la note complémentaire 3) . FWMOT est capable de fournir un SNR élevé pour une excitation simultanée avec plusieurs longueurs d'onde, sans allonger le temps d'acquisition (1 ms) et atteindre le même DoV (7,5 mm) et SNR (ici encore N = 90,6 μV et S = 12 mV, résultant en un SNR de 21,2 dB pour la longueur d'onde 1).

Nous nous attendrions à une augmentation du SNR de 3 dB en augmentant le nombre de mesures moyennes de 50 à 200. Cependant, nous avons mesuré une augmentation du SNR de 2,3 dB pour la moyenne TD et le FWM. Cet écart peut être attribué à la présence de bruit électromagnétique systématique dans le système, qui est également moyenné et réduit le SNR de 0,7 dB. Cependant, cet effet est une caractéristique générale du système OA et non un inconvénient de l'algorithme FWM.

Nous avons également comparé le SNR obtenu dans l'optoacoustique FD conventionnelle à FWMOT en utilisant le même fantôme de vernis noir et un éclairage à une seule longueur d'onde à 445 nm (voir Fig. 1 supplémentaire). L'optoacoustique FD a utilisé une onde sinusoïdale de fréquence de 20 MHz avec une puissance moyenne ajustée pour égaler la puissance de sortie moyenne du motif pulsé FWMOT utilisé pour des impulsions de 6,8 ns à 200 KHz. FWMOT a démontré un SNR supérieur de 20,8 dB par rapport à l'excitation FD.

Alors que les mérites théoriques du fonctionnement optoacoustique FWM ont été démontrés avec des mesures fantômes, une étape critique suivante consistait à examiner si FWM pouvait offrir des implémentations réalistes. Pour cette raison, nous avons cherché à déterminer si les avantages théoriques pouvaient conduire à des caractéristiques opérationnelles (SNR, vitesse d'acquisition) qui rendraient FWMOT approprié pour des applications in vivo. Un paramètre inconnu particulier dans cette interrogation était la performance FWMOT obtenue avec plusieurs longueurs d'onde utilisant des diodes laser, car il serait impossible de mettre en œuvre FWMOT avec plusieurs lasers à semi-conducteurs en raison du coût et de la taille. Pour examiner les mérites de l'utilisation d'une technologie à faible coût, nous avons étudié les performances de plusieurs diodes laser pour imager le système vasculaire et lymphatique in vivo, en utilisant l'oreille de la souris comme modèle. Cette cible d'imagerie a été sélectionnée car il s'agit d'un tissu typique sur lequel les implémentations optoacoustiques TD ont été classiquement démontrées.

Tout d'abord, nous avons évalué si FWMOT pouvait produire des images de haute qualité à partir de spécimens biologiques. Nous avons utilisé un éclairage FWM à 445 nm et 465 nm et résolu l'oxy- et la désoxy-hémoglobine (Fig. 3a, b) en fonction de leur différence spectrale, l'hémoglobine désoxygénée absorbant plus à 445 nm, et vice-versa. Les données ont été collectées sur une grille et ont d'abord été moyennées point par point à l'aide de l'algorithme FWM avant d'être introduites dans l'algorithme de reconstruction (voir méthodes). La superposition des Fig. 3a, b a révélé une image composite à code couleur (Fig. 3c) de l'oxygénation vasculaire relative, la couleur rouge correspondant à des niveaux d'oxygénation plus élevés. Nous avons en outre confirmé que FWMOT peut produire des images résolues en profondeur (voir Fig. 2 supplémentaire) sans diaphonie entre les longueurs d'onde, offrant la première preuve que FWMOT peut acquérir des images à partir de tissus biologiques basés sur des LD.

a et b Une oreille de souris aux deux longueurs d'onde bleues, respectivement 445 et 465 nm, avec une résolution spatiale élevée. c La couleur de l'image composite codée en rouge indique des niveaux d'oxygénation plus élevés par rapport au vert. d, e, f, g Une deuxième oreille de souris aux quatre longueurs d'onde. h Une image en fond clair de l'oreille de la souris. Des taches d'injection intradermique d'Evan's Blue et d'ICG sont visibles sur les images (f, g, h). f, g Les colorants injectés pénètrent dans les vaisseaux lymphatiques qui présentent une structure différente des vaisseaux sanguins. i L'image composite des quatre longueurs d'onde. Nous pouvons observer des vaisseaux sanguins oxygénés (rouges), désoxygénés (verts) et des vaisseaux lymphatiques après absorption simultanée d'Evan's Blue (cyan) et d'ICG (violet). Ces expériences ont été répétées dix fois indépendamment avec des résultats similaires. Toutes les images sont des projections d'amplitude maximale d'images reconstruites. Le vert est de 445 nm, le rouge est de 465 nm, le cyan est de 638 nm, le violet est de 808 nm, la barre d'échelle est de 1 mm.

Nous avons ensuite cherché à déterminer si le FWMOT pouvait visualiser plusieurs fragments dans les tissus sans compromettre les caractéristiques opérationnelles comme dans le TD. Nous avons introduit un contraste exogène par injection intradermique de bleu d'Evan et de vert d'indocyanine (ICG) et appliqué un FWMOT à 4 longueurs d'onde pour résoudre simultanément les artères et les veines (Fig. 3d, e) et les vaisseaux lymphatiques révélés par l'amélioration du contraste (Fig. 3f, g). La figure 3h montre l'image correspondante en champ clair de l'oreille de la souris. L'image composite de quatre longueurs d'onde (Fig. 3i) a permis la visualisation et la co-localisation des vaisseaux vasculaires et lymphatiques. Notamment, l'utilisation d'un transducteur ultra-large bande a permis de résoudre les structures fines représentées par les vaisseaux ainsi que les larges zones absorbantes qui se sont formées autour des sites d'injection. FWMOT peut donc être utilisé efficacement pour effectuer une imagerie OA avec plusieurs longueurs d'onde simultanément in vivo avec une acquisition d'environ 30 min, tandis que la même mise en œuvre multispectrale en TD nécessite environ 2 h, ce qui rend une telle mesure peu pratique.

L'accélération d'acquisition FWM sur TD démontrée sur la figure 3 indique également une utilisation FWMOT pour détecter des changements rapides simultanément en utilisant plusieurs longueurs d'onde. Nous avons donc appliqué FWMOT pour surveiller les fluctuations d'oxygénation dans l'oreille de la souris lors d'un test de stress oxygéné in vivo. La figure 4a montre l'image composite OA à partir de 2 longueurs d'onde bleues révélant les vaisseaux oxygénés et désoxygénés. Nous avons sélectionné une ligne de 2 mm (Fig. 4a; boîte bleue) pour acquérir des signaux de manière répétée (fonctionnement FWM continu) à une fréquence d'environ 4 Hz. Un B-scan (indiqué par la lettre (i) sur la Fig. 4a) a révélé une artère (rouge) et une veine (verte) en fonction de la profondeur. Le défi à l'oxygène a été fourni en alternant la composition du gaz respiratoire de 0,8 litre par minute (lpm) d'O2 à 100 % (Fig. 4b ; « O2 ») à 0,6 lpm d'O2 à 20 % plus 0,2 lpm de CO2 (Fig. 4b ; "Air"). La figure 4b trace le rapport du signal de longueur d'onde 2 (S2) sur le signal de longueur d'onde 1 (S1) dans le temps. Le rapport S2/S1 est indicatif des changements relatifs d'oxygénation dans les vaisseaux au fil du temps. Comme prévu, une oxygénation plus élevée a été observée dans l'artère que dans la veine tout au long de l'expérience. L'oxygénation a été réduite pendant l'apport d'air et a augmenté lorsque 100 % d'O2 a été fourni. Les niveaux d'oxygénation dans l'artère ont augmenté plus rapidement en réponse au passage de l'apport d'air à l'apport d'O2 par rapport à la veine, révélant la dynamique attendue de l'apport d'oxygène aux tissus.

a Les images OA dans les longueurs d'onde bleues, montrant des vaisseaux oxygénés (rouge) et désoxygénés (vert). Nous avons effectué en continu des B-Scans sur la région bleue notée en a et 'i' montre une telle coupe transversale. La flèche verte et la région en « i » indiquent la veine sélectionnée, et la flèche et la région rouges indiquent l'artère sélectionnée. Le vert correspond à 445 nm, le rouge à 465 nm, la barre d'échelle 1 mm. b Les changements dans le rapport entre l'intensité du signal OA dans la longueur d'onde 2 (S2) et celle de la longueur d'onde 1 (S1) dans le temps pendant un test de stress à l'oxygène. La saturation en oxygène est proportionnelle au rapport S2/S1. La saturation en oxygène change plus rapidement dans l'artère que dans la veine, comme prévu. c Le taux d'extraction d'oxygène au cours de la même expérience. d L'intensité du signal aux longueurs d'onde 3 et 4 (respectivement S3 et S4) au niveau de la même artère et de la même veine indiquée en a lors de l'injection intravasculaire des deux colorants, le bleu d'Evan et l'ICG. Dans les deux cas, l'intensité du signal augmente d'abord dans l'artère et ensuite dans la veine. Ces expériences ont été répétées trois fois indépendamment avec des résultats similaires.

Le taux d'extraction d'oxygène (OER sur la Fig. 4c), une indication de l'absorption d'oxygène par les cellules, a été calculé comme OER = (Oca - Ocv)/Oca, où Oca et Ocv sont la saturation en oxygène dans l'artère centrale et la veine, respectivement29 . Nous avons observé que l'OER a légèrement baissé peu de temps après la période d'approvisionnement en air, suggérant une réponse retardée dans l'oxygénation cellulaire. Lorsque l'apport d'oxygène a été augmenté au cours des deuxième et troisième périodes d'approvisionnement en O2, une augmentation de l'OER a été observée suivie d'un retour à des niveaux normaux, suggérant que les cellules consommaient plus d'oxygène au fur et à mesure qu'il devenait disponible. L'expérience de test de stress d'oxygène confirme que FWMOT est une méthode qui peut être utilisée pour étudier la dynamique des tissus avec une capacité de localisation élevée, confirmée par l'injection intraveineuse d'ICG et d'Evan's Blue. En utilisant le même champ d'observation de 2 mm, FWMOT a enregistré la dynamique de l'agent de contraste à 638 et 808 nm (Fig. 4d). Nous avons observé un schéma post-injection similaire pour les deux colorants, révélant deux pics distincts avant de se stabiliser à une valeur de base, indicative de la dynamique de circulation des colorants dans le système vasculaire. Nous avons en outre résolu l'apparition retardée des agents dans la veine pour les deux colorants, le signal observé augmentant à un rythme inférieur à celui de l'artère, un schéma attribué à la diffusion du colorant dans le réseau capillaire tissulaire.

Nous introduisons une méthode optoacoustique basée sur le multiplexage de fréquence, qui remet en question la notion dominante selon laquelle les implémentations TD offrent les meilleures performances optoacoustiques. En combinant les avantages de l'excitation TD, c'est-à-dire l'excitation pulsée, avec l'analyse FD, FWMOT offre des performances supérieures à TD ou FD à excitation multi-longueur d'onde. L'augmentation du nombre de longueurs d'onde (N) dans TD compromet la profondeur de vue, le SNR ou le temps d'acquisition total. FWMOT peut fournir un éclairage simultané à plusieurs longueurs d'onde sans sacrifier aucun de ces paramètres, permettant soit un SNR plus élevé d'un facteur \(\sqrt{N}\) par longueur d'onde, un temps d'acquisition plus court d'un facteur N, ou N fois plus de profondeur -de-vue par longueur d'onde par rapport à TDOA. De plus, l'utilisation de trains d'impulsions conduit à des implémentations pratiques de FWMOT en fournissant les fréquences discrètes nécessaires dans le domaine fréquentiel, tout en évitant la génération de signaux FD par fonctionnement direct dans le domaine fréquentiel à l'aide de systèmes de modulation multifréquence élaborés.

Un autre aspect critique ici était non seulement de montrer la supériorité théorique de la méthode, mais aussi de démontrer qu'elle peut conduire à des implémentations pratiques. Une technologie habilitante qui a permis de telles performances était l'utilisation de diodes laser à onde continue surexcitées (CW-LD)26 qui sont intrinsèquement rentables, portables et compactes, conduisant à des systèmes avec un potentiel de diffusion élevé. Les LD sont parfaitement adaptés au FWMOT et peuvent être utilisés pour remplacer les lasers à semi-conducteurs. Outre leur petit facteur de forme et leur disponibilité à plusieurs longueurs d'onde, les LD peuvent être pulsées à des taux de répétition d'impulsions très élevés, correspondant à la capacité FWMOT optimale unique de multiplexer et de moyenner les signaux, augmentant le SNR. De nouveaux LD plus puissants entrant sur le marché contribueront à de nouvelles améliorations des performances du FWMOT, offrant des systèmes compacts et peu coûteux avec un potentiel de diffusion élevé pour diverses applications9,27.

L'imagerie à quatre longueurs d'onde a différencié la vascularisation sanguine des vaisseaux lymphatiques in vivo, réduisant le temps d'acquisition de 2 h requis en TD à ~ 30 min. Le FWMOT a également atteint un taux d'acquisition quatre fois plus élevé que le TD lors de l'exécution de B-Scans sur l'artère et la veine principales, permettant la surveillance des changements relatifs d'oxygénation et le calcul du taux d'extraction d'oxygène. Par conséquent, FWMOT est particulièrement adapté aux mesures dynamiques ou aux expériences nécessitant une anesthésie, améliorant également le débit associé par rapport aux implémentations TD.

Il existe également une limite au nombre maximal de longueurs d'onde utilisées dans FWMOT qui dépend de la bande passante de détection UST, du temps d'acquisition ou du nombre de moyennes dans les trains d'impulsions et du taux de répétition de L1 utilisé dans chaque cas. Lorsque frep,1 = 200 kHz, Np = 100 et la bande passante UST entre 22 et 78 MHz, le nombre maximum de longueurs d'onde est de 28 pour FWMOT contre seulement 5 pour les implémentations TD avec les mêmes paramètres de fonctionnement et un DoV de 1,5 mm par longueur d'onde (voir la note complémentaire 4). Plus il y a de longueurs d'onde utilisées dans FWMOT, plus l'augmentation du SNR par longueur d'onde est importante par rapport à TDOA. L'utilisation de nombreuses longueurs d'onde simultanées serait particulièrement intéressante pour améliorer la spécificité de détection moléculaire de la spectroscopie OA.

En résumé, FWMOT permet une imagerie SNR rapide et élevée en utilisant plusieurs longueurs d'onde simultanément sans compromettre le DoV et peut offrir un outil précieux pour étudier les processus moléculaires dynamiques, révolutionnant la façon dont l'imagerie multispectrale OA sera effectuée à l'avenir.

La figure 5 présente le système de mésoscopie optoacoustique à balayage multispectral (RSOM) développé pour tester les avantages du FWMOT. Matlab (Matlab 2016b, Mathworks, USA) a été installé sur un PC, contrôlant le système (Fig. 5a). Le PC contrôle le pilote d'étages à double canal (C-867.260, Physik Instrumente, Allemagne) qui pilote les étages x-y doubles placés sur la tête de balayage (Fig. 5c) et est synchronisé avec deux générateurs de formes d'onde arbitraires (AWG, 33522B, Keysight, États-Unis). Les AWG déclenchent les pilotes de diode laser et fournissent une impulsion de synchronisation à la carte d'acquisition de données (DAQ, 12 bits, 200 MS/s, Razor Express 14x2 Compuscope, Dynamic Signals LLC, USA) pour l'acquisition synchrone du signal. La sortie lumineuse du système d'éclairage est dirigée vers la tête de balayage, une petite partie entrant dans une photodiode (DET10A2/M, Thorlabs, USA). Le signal de la photodiode est filtré analogiquement (BLP-90+, Minicircuits, USA) et enregistré pour surveiller les fluctuations d'énergie d'impulsion à impulsion et la gigue temporelle, corrigées pour les deux pendant le post-traitement du signal. Le signal OA de l'UST est amplifié avec un amplificateur de gain de 60 dB (Miteq AU-1291-R, Miteq, USA) et filtré analogiquement (BLP-90+ et ZFHP-1R2-S+, Minicircuits, USA) avant d'être numérisé par le DAQ pour éviter le crénelage.

a Le schéma du système développé montrant les connexions électriques et optiques des différentes parties du système. b Le système d'éclairage à diode laser. Chaque diode laser est fixée à un pilote de diode laser séparé et focalisée dans une fibre multimode avec un système à 2 lentilles. Les quatre diodes laser sont couplées dans un combineur de puissance à fibre 4 × 4 et chaque sortie du combineur a ~ 25% de la puissance de chaque entrée, combinant toutes les longueurs d'onde. c La tête de balayage du système RSOM comprenant les étages de balayage x–y (i), le support imprimé en 3D (ii), le transducteur à ultrasons (iii) et les quatre fibres de sortie du combinateur de puissance de fibre (iv) disposées dans un motif circulaire autour de l'UST. Composants d'image adaptés avec la permission des détenteurs des droits d'auteur ; les composants optomécaniques en b proviennent de Thorlabs Inc. et les platines de balayage (U-723 XY) en c de Physik Instrumente GmbH (https://www.physikinstrumente.com/en/products/xy-stages/u-723- piline-xy-stage-1000583/#téléchargements).

Le système d'éclairage (Fig. 5b) se compose de quatre diodes laser CW qui ont été surexcitées avec quatre pilotes de diode laser à haute intensité et à impulsions courtes développés précédemment26. En bref, le courant de crête des LD est brièvement (pendant des nanosecondes) augmenté à> 40 fois leur maximum absolu CW, ce qui permet aux LD de fournir une puissance de crête jusqu'à 27 fois supérieure à la limite maximale absolue spécifiée par le fabricant. Les diodes laser utilisées dans ce travail sont la LDM-445-6000 (LaserTack, Allemagne) émettant à 445 nm, la LDM-465-3500 (LaserTack, Allemagne) émettant à 465 nm, la HL63283HG (Ushio, Japon) émettant à 638 nm et le K808D02FN (BWT, Chine) émettant à 808 nm, nommés respectivement laser 1, laser 2, laser 3 et laser 4. Chaque diode laser est focalisée dans une fibre multimode. Afin de positionner chaque diode laser dans une platine X-Y manuelle (CXY1, Thorlabs, USA), une lentille de collimation (C340TMD, Thorlabs, USA) est placée devant elle sur une platine z manuelle (SM1Z, Thorlabs, USA ), suivie d'une lentille de focalisation (C560TME, Thorlabs, USA) maintenue stable et de la fibre sur un étage ax-y (CXY1, Thorlabs, USA). La fibre avec un diamètre de noyau de 200 um et 0,22 NA était l'une des 4 entrées du combinateur de puissance à fibre 4x4. Les quatre sorties du combinateur de fibres (MPC-4-M21-M41-P23, Lasfiberio, Chine) contiennent environ 25 % de la puissance d'entrée de chaque fibre d'entrée et sont également des fibres multimodes avec un cœur de fibre de 200 µm et 0,22 NA. L'une des sorties est connectée à un séparateur 95-5% personnalisé (LTL 500-93310-95-1, LaserComponents Germany GmBH, Allemagne) et la fibre 5% a été connectée à la photodiode. Les 3 sorties du combinateur de puissance et la fibre à 95 % du séparateur ont été terminées par des ferrules de 1,25 mm (SFLC230, Thorlabs, USA) et dirigées vers la tête de balayage.

La tête de balayage (Fig. 5c) se compose de l'étage x-y (U-723 XY, Physik Instrumente, Allemagne), du support imprimé en 3D, du transducteur à ultrasons (UST, HFM23, Sonaxis, France) avec une fréquence centrale de 50 MHz et une bande passante relative de 112 %, une distance focale de 3 mm et 0,5 NA, et les quatre fibres de sortie disposées selon un motif circulaire autour de l'UST. La sortie des quatre fibres est conçue pour se croiser au foyer de l'UST afin d'obtenir une densité d'énergie maximale sur l'échantillon.

La numérisation et l'enregistrement sont effectués dans un mouvement semblable à un balayage en utilisant le pilote d'étapes comme maître dans le système. L'étage x se déplace en ligne droite avec une vitesse constante. Lorsque l'étage x a parcouru une distance spécifique, égale à la taille du pas, le pilote d'étages envoie un signal aux AWG pour déclencher les diodes laser. Chaque diode laser est déclenchée à l'aide d'un train d'impulsions avec un taux de répétition frep,1–frep,4 pour chaque diode laser et un nombre Np1–Np4 d'impulsions à chaque point (A-Scan) dans le B-Scan. Une fois que la platine a parcouru la distance souhaitée, le B-Scan est terminé et les platines s'arrêtent de bouger. La platine y est déplacée vers la position y suivante et la platine x peut maintenant effectuer le B-Scan suivant dans la direction opposée. Pour l'excitation FWMOT nous avons utilisé frep,1 = 200 000 Hz, frep,2 = 200 125 Hz, frep,3 = 200 250 Hz et frep,4 = 200 375 Hz et Np1 = 100 et Np2 = Np3 = Np4 = 101 impulsions pour les lasers 1, 2, 3 et 4, respectivement. Pour une dérivation détaillée de ces valeurs, voir la note complémentaire 2.

Nous avons enregistré les spectres d'émission des 4 diodes laser utilisées dans la diode laser multispectrale RSOM avec un spectromètre (USB4000, OceanOptics, Royaume-Uni) et les longueurs d'onde d'émission maximales étaient de 444,3, 460,1, 636,8, 804,9 nm avec une variance de 1,6, 1,7, 1,9 , 2,2 nm respectivement et un niveau de confiance R2 supérieur à 0,96 pour tous les cas.

De plus, l'énergie par impulsion sur les échantillons a été mesurée avec un wattmètre thermique stabilisé (PM160T, Thorlabs, USA) et calculée comme 189, 137, 142, 153 nJ par impulsion pour les lasers 1, 2, 3, 4, respectivement. La largeur d'impulsion a été estimée à 6,7, 6,7, 10,2, 10,2 ns pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) pour chaque laser respectivement. À l'aide d'une caméra CCD USB (daA1920-30 µm; Basler AG, Allemagne), le point d'éclairage à la surface de l'échantillon a été mesuré comme étant un cercle d'un diamètre d'environ 1 mm. Le tableau 1 présente un résumé des caractéristiques d'impulsion et d'émission LD pour le fonctionnement FWMOT comme présenté ci-dessus.

Pour comparer l'excitation FD OA à FWMOT, nous avons utilisé une diode laser 450 nm couplée à la fibre (FBLD-450-0.8W-FC105-BTF ; Frankfurt Laser Company, Allemagne) connectée à un pilote laser analogique (BFS-VRM 03 HP ; Picolas, Allemagne). La fibre de sortie du laser a été pompée dans l'une des fibres d'entrée du combinateur de fibres 4 × 4, de sorte que l'éclairage de l'échantillon soit identique pour l'excitation FD et le système d'excitation FWMOT.

Pour calculer le rapport signal sur bruit (SNR), nous avons utilisé la formule suivante, 10 * log10(S / N), où S est l'intensité du signal et N l'écart type du bruit de fond.

L'acquisition d'image se produit dans un grand champ de vision (10 × 10 mm2) et avec une taille de pas de balayage de 10 µm afin d'être bien inférieure à la résolution latérale du système. Les signaux résolus dans le temps détectés à chaque position de balayage correspondent à l'intégration des ondes acoustiques sphériques provenant des absorbeurs optiques éclairés dans l'angle de détection du transducteur. Par conséquent, les images non traitées obtenues directement à partir du système sont fortement floues et nécessitent un traitement supplémentaire pour obtenir des images à contraste élevé et à haute résolution. Pour ce faire, un algorithme de rétroprojection est implémenté dans le domaine de Fourier30,31 pour récupérer une image (acoustiquement) limitée en diffraction. L'image résultante est ensuite corrigée par la réponse impulsionnelle du système32 et ensuite traitée avec un filtre de vassalité à des fins d'affichage33. Les données brutes d'un seul B-Scan ne permettent pas la reconstruction d'images 3D. Par conséquent, une version simplifiée de l'algorithme de rétroprojection a été développée, qui fonctionne en deux dimensions et se rapproche du champ de sensibilité des transducteurs comme une section conique le long de la direction B-Scan uniquement.

Pour calculer la résolution spatiale du système, nous avons imagé une cible de résolution (une étoile de Siemens) en utilisant les 4 longueurs d'onde. Les résultats sont présentés dans la Fig. 3 supplémentaire, qui montre les images OA reconstruites de la cible de résolution aux quatre longueurs d'onde, ainsi que l'image composite en coordonnées polaires. La résolution spatiale est donnée par le plus petit rayon auquel toutes les lignes peuvent être bien résolues (Fig. 3h supplémentaire), qui est de 38 µm pour toutes les longueurs d'onde.

L'hémoglobine a un large spectre d'absorption dans le visible et le proche infrarouge avec une absorption plus élevée aux longueurs d'onde inférieures du spectre. L'absorption de l'hémoglobine désoxygénée est supérieure à l'absorption de l'hémoglobine oxygénée à 444 nm. L'absorption de l'hémoglobine oxygénée est supérieure à l'absorption de l'hémoglobine désoxygénée à 460 nm. L'absorption totale de l'hémoglobine aux longueurs d'onde 1 et 2 est beaucoup plus élevée que celle aux longueurs d'onde 3 et 4. En raison de la faible puissance de sortie des diodes laser, cela suffit pour supposer que nous n'avons détecté que les signaux OA de l'hémoglobine aux longueurs d'onde 1 et 2 Cela a été confirmé par les expériences d'oreille de souris in vivo. De plus, nous pouvons estimer les changements relatifs de la saturation en oxygène34 en calculant le rapport de l'intensité du signal de la longueur d'onde 2 sur celle de la longueur d'onde 1, S2/S1, un rapport plus élevé indiquant une saturation en oxygène plus élevée.

Pour induire un contraste et augmenter le SNR aux longueurs d'onde 3 et 4, nous avons utilisé deux colorants, Evan's Blue (Sigma-Aldrich, Allemagne) et ICG (VERDYE, Allemagne). Le bleu d'Evan a un pic d'absorption à 640 nm et un minimum à 740 nm35, ce qui en fait le colorant approprié pour améliorer le contraste pour la longueur d'onde 3, car c'est la seule longueur d'onde où nous pouvons détecter les signaux OA. L'ICG dans le plasma sanguin a un pic d'absorption à environ 810 nm et une faible absorption à 637 nm36, ce qui rend approprié d'induire un contraste OA à la longueur d'onde 4 avec un contraste minimal à la longueur d'onde 3 et aucun contraste aux autres longueurs d'onde, confirmé par les expériences sur l'oreille de la souris .

En utilisant les valeurs mentionnées ci-dessus (tableau 1) pour chaque diode laser et une vitesse de balayage de 10 mm/s pour une taille de pas de balayage de 10 μm, nous pouvons calculer l'exposition de l'échantillon. L'exposition totale de l'échantillon pour une illumination simultanée avec les quatre longueurs d'onde est calculée comme étant de 19,8 µJ/cm2 par impulsion et 3,96 W/cm2 d'exposition moyenne, bien en deçà des limites d'EMT de 20 mJ/cm2 et 18 W/cm2, imposées par le Institut national américain de normalisation37. Il a été démontré que des effets non linéaires dans l'arthrose sont présents à des densités d'énergie élevées supérieures à ~7 mJ/cm2 38. L'exposition totale de l'échantillon ici était inférieure à 20 µJ/cm2, même dans le cas d'un éclairage simultané avec toutes les longueurs d'onde. Par conséquent, l'énergie déposée dans cette étude était bien inférieure au seuil des effets non linéaires.

Pour nos expériences, nous avons utilisé deux souris Athymic nude-Foxn1nu âgées de 5 à 6 semaines (Envigo, Allemagne). Pendant toutes les mesures, les souris ont été anesthésiées par 1,6% d'isoflurane (cp-Pharma, Allemagne) avec un débit de gaz porteur de 0,8 lpm et la température corporelle a été maintenue avec une lampe chauffante infrarouge et une plaque chauffante.

La première souris a été utilisée pour les expériences présentées à la Fig. 3. Les vaisseaux lymphatiques de l'oreille ont été mis en évidence par l'administration intradermique de 5 µl d'ICG (5 mg/ml) et de 5 µl de bleu d'Evan (1 %) dans le bout de l'oreille de la souris. L'ICG a été administré ~ 30 min et le bleu d'Evan ~ 10 min avant de commencer l'imagerie pour assurer le drainage lymphatique des colorants.

Une deuxième souris a été utilisée pour les expériences illustrées à la Fig. 4. Pour l'expérience de stress en oxygène, nous avons fourni différentes combinaisons de gaz vecteur isoflurane ou conditions respiratoires à travers un masque nasal. La souris respirait alternativement 0,8 lpm d'oxygène à 100 % (O2) et une combinaison de 0,6 lpm d'air médical (20 % d'oxygène) plus 0,2 lpm de dioxyde de carbone CO2 (air). Pour l'expérience de diffusion de colorant, nous avons d'abord acquis les données de fond et après 3 min, injecté par voie intraveineuse 100 µl de solution de bleu d'Evan à 1 %, et après encore 3 min, 100 µl de la solution d'ICG à 5 mg/ml. Les deux souris ont été sacrifiées immédiatement après l'imagerie par dislocation cervicale.

Toutes les expériences de souris ont été réalisées selon le comité sur la santé et les soins des animaux de Haute-Bavière, Allemagne (Az. ROB-55.2-2532.Vet_02-14-88 et Az. ROB-55.2-2532.Vet_02-18-120). Les souris ont été maintenues dans un système individuel de cage ventilée (Tecniplast, Allemagne) à une température ambiante de 22 °, une humidité relative d'environ 50 % et un cycle jour/nuit régulier de 12 h dans notre installation de souris sans pathogène spécifique (SPF) à le Centre de recherche translationnelle sur le cancer de l'Université technique de Munich (TranslaTUM).

L'un des auteurs s'est porté volontaire pour cette étude afin de se faire imager la main. Après consultation de la commission d'éthique du TUM, aucune approbation formelle n'a été nécessaire. Le consentement éclairé du participant a été obtenu et archivé. Le participant est un homme blanc de 30 ans. L'acquisition de l'image s'est produite dans un champ de vision de 5 × 5 mm2 et avec un pas de balayage de 10 µm. Les images OA reconstruites sont présentées dans la Fig. 2 supplémentaire.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données brutes du signal optoacoustique pour valider l'algorithme de tomographie optoacoustique multiplexée en longueur d'onde de fréquence, les données brutes d'imagerie des souris et des humains, les données brutes B-Scan du test de stress à l'oxygène et les expériences d'injection ICG et Evan's Blue qui ont été générées dans cette étude ont été déposé dans la base de données Zenodo sous le code d'accès : https://doi.org/10.5281/zenodo.6770729.

Les auteurs déclarent que pour la collecte de données, le logiciel disponible dans le commerce de GaGe (Compuscope Driver Version 5.04.34, Dynamic Signals LLC, USA) et Matlab 2016b (Matlab, Mathworks, USA) a été utilisé. L'analyse des données a été effectuée dans Matlab en utilisant ses fonctions intégrées. L'algorithme de tomographie optoacoustique multiplexée en longueur d'onde de fréquence a été breveté et est disponible à la discrétion de l'auteur correspondant.

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La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Bonn, Allemagne (Project Sense4Life, 13N13855) (VN), du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre de la recherche et de l'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne. programme sous convention de subvention n° 694968 (PREMSOT) (VN) et du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne sous convention de subvention n° 732720 (ESOTRAC) (VN) et n° 862811 (RSENSE) (VN). Nous tenons à remercier le Dr Sergey Sulima et le Dr Robert Wilson pour leur aide à la rédaction du manuscrit.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Chaire d'imagerie biologique à l'Institut central de recherche translationnelle sur le cancer (TranslaTUM), École de médecine, Université technique de Munich, Munich, Allemagne

Antonios Stylogiannis, Ludwig Prade, Sarah Glasl, Qutaiba Mustafa, Christian Zakian & Vasilis Ntziachristos

Institut d'imagerie biologique et médicale, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Allemagne

Antonios Stylogiannis, Ludwig Prade, Sarah Glasl, Qutaiba Mustafa, Christian Zakian & Vasilis Ntziachristos

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AS et LP ont développé le système RSOM à longueurs d'onde multiples. LP a développé la technique de traitement du signal multiplexé en longueur d'onde de fréquence. AS a ensuite travaillé sur l'algorithme multiplexé en longueur d'onde de fréquence, a développé la source d'excitation CW-LD saturée, a réalisé les expériences d'imagerie et a traité les données. SG a aidé AS à réaliser les expériences sur les souris. QM a reconstruit les images optoacoustiques. CZ et VN ont aidé avec des discussions approfondies et des conseils dans la conduite de cette recherche.

Correspondance à Vasilis Ntziachristos.

VN est fondateur et actionnaire de sThesis GmbH, iThera Medical GmbH, Spear UG et i3 Inc. Les autres auteurs n'ont pas d'intérêts concurrents.

Nature Communications remercie Frans Harren et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Stylogiannis, A., Prade, L., Glasl, S. et al. Tomographie optoacoustique multiplexée en longueur d'onde de fréquence. Nat Commun 13, 4448 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32175-6

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Reçu : 06 juillet 2021

Accepté : 20 juillet 2022

Publié: 01 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32175-6

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