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Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 16730 (2022) Citer cet article

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Plusieurs études récentes ont établi l'efficacité de la thérapie de photobiomodulation (PBMT) dans des conditions cliniques douloureuses. La neuropathie diabétique (DN) peut être liée à l'activation des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK), telles que p38, dans le nerf périphérique. La voie MAPK est activée en réponse à des stimuli extracellulaires, notamment les interleukines TNF-α et IL-1β. Nous avons vérifié le potentiel de soulagement de la douleur du PBMT chez des rats neuropathiques diabétiques induits par la streptozotocine (STZ) et son influence sur la régulation de la voie MAPK et la dynamique du calcium (Ca2+). Nous avons ensuite observé que le PBMT appliqué à la région du ganglion de la racine dorsale (DRG) L4-L5 réduisait l'intensité de l'hyperalgésie, diminuait les niveaux de TNF-α et d'IL-1β et l'expression de l'ARNm de p38-MAPK dans le DRG de rats neuropathiques diabétiques. DN a induit l'activation de la MAPK p38 (p-38) phosphorylée co-localisée avec les neurones TRPV1+ ; PBMT a partiellement empêché l'activation de p-38. La DN était liée à une augmentation de l'expression de p38-MAPK due aux interleukines pro-inflammatoires, et le traitement PBMT (904 nm) a contrecarré cette condition. De plus, la sensibilisation des neurones DRG par l'état hyperglycémique démontré au cours de la dynamique du Ca2+ a été réduite par le PBMT, contribuant à ses effets anti-hyperalgésiques.

Le diabète peut endommager le système nerveux périphérique (SNP) de diverses manières, et la neuropathie diabétique (DN) est l'une des complications les plus courantes du diabète non traité1. La DN est une maladie complexe chronique qui affecte les nerfs périphériques, provoquant une affection douloureuse impliquant les membres supérieurs et inférieurs1,2,3,4 avec un taux d'incidence d'environ 70 % des patients diabétiques5,6. Le mécanisme par lequel l'hyperglycémie entraîne une lésion des nerfs périphériques n'est pas très clair, mais on sait que plusieurs voies métaboliques sont affectées7. Les principaux événements impliquent la voie des polyols, via l'activation de l'aldose réductase (AR)8,9,10,11, la glycosylation des protéines et la production de produits terminaux de glycation avancée (AGE)10,12,13. De plus, la formation de radicaux libres liés au stress oxydatif14,15, le soutien neurotrophique réduit16,17 et l'activation accrue de la protéine kinase C (PKC)9,18 contribuent aux dommages périphériques. En raison du déséquilibre métabolique, la défaillance mitochondriale10,19,20 et les processus inflammatoires sont également fréquents et liés à la phosphorylation des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK)21,22,23,24,25.

MAPK est une famille de protéines kinases à sérine/thréonine responsables de la transduction de stimuli extracellulaires en réponses intracellulaires post-traductionnelles et transcriptionnelles26,27,28. Il comprend p38-MAPK, la protéine kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK1/2) et la kinase N-terminale c-Jun/protéine kinase activée par le stress (SAPK/JNK)29. Les trois principales sous-familles de MAPK (p38, ERK1/2 et JNK) coordonnent plusieurs fonctions : transcription génique, synthèse protéique, cycle cellulaire, prolifération, différenciation et apoptose30,31,32,33. Les stimuli extracellulaires, tels que les cytokines pro-inflammatoires34,35,36 et le stress oxydatif30,37 peuvent activer la voie MAPK, également sous l'influence de la dynamique du Ca2+38,39. La dépolarisation membranaire peut favoriser l'afflux de calcium à travers les canaux calciques de type L et active MEK1, qui phosphoryle MAPK39. L'hyperglycémie semble être l'un des facteurs qui pourraient stimuler la phosphorylation des MAPKs40,41, une fois l'activation de p38 observée dans les neurones sensoriels périphériques de rats diabétiques42, plus précisément dans les ganglions de la racine dorsale (DRG)43,44,45,46. De même, la phosphorylation de JNK conduit à l'apoptose des neurones stressés par l'hyperglycémie via l'activation de la caspase-322,47,48,49. De plus, la signalisation MAPK stimule l'expression du sous-type 1 vanilloïde potentiel du récepteur transitoire (TRPV1) dans la douleur chronique, un canal hautement perméable au Ca2+50. Cela implique plusieurs complications du diabète, dont l'hyperalgésie thermique51.

Du fait de la complexité des altérations métaboliques observées dans la DN, il existe plusieurs cibles pharmacologiques pour traiter l'état douloureux, mais avec une faible efficacité. La plupart des patients se réfèrent à un certain soulagement des symptômes, mais celui-ci régresse avec le temps, même avant la fin du traitement52. Caractérisée comme un processus non thermique, la thérapie de photobiomodulation (PBMT) implique l'activation de chromophores cellulaires spécifiques, tels que la cytochrome c oxydase (CCO ; complexe mitochondrial IV) avec une irradiation rouge et infrarouge53. Ce processus est déclenché par des réactions photophysiques et photochimiques à l'intérieur des cellules lorsque la lumière traverse la membrane cellulaire54,55,56, provoquant la modulation de voies spécifiques liées à la survie cellulaire, telles que l'augmentation de l'adénosine triphosphate (ATP), la production d'oxygène et libération d'oxyde nitrique (NO)57. De ce fait, la photobiomodulation peut être utilisée comme thérapie pour traiter certaines affections douloureuses58,59,60,61,62,63,64,65 dont la DN, au moins complémentaire, comme observé dans une précédente étude menée par notre groupe66. Sur cette base, cette étude visait à analyser les effets anti-hyperalgésiques du PBMT (904 nm) sur la neuropathie diabétique induite par la streptozotocine (STZ), en considérant le rôle de la voie MAPK dans l'évolution de la maladie et en tant que cible du PBMT. mécanisme.

Le protocole d'induction du DT1 par de faibles doses de STZ (cinq faibles doses, une seule dose de 25 mg/kg par jour) était adapté à l'installation de l'hyperglycémie irréversible. Tous les rats soumis aux injections de STZ (groupes STZ et STZ + PBMT) sont devenus hyperglycémiques (≥ 250 mg/dL de glycémie ; 349,07 ± 48,23 mg/dL) après cinq faibles doses de STZ, atteignant le seuil d'hyperglycémie entre la quatrième et la cinquième jours (Fig. 1A, B). Les rats hyperglycémiques présentaient également une polyurie, une polyphagie et une polydipsie (données non présentées). Ils ont cessé de prendre du poids, avec une légère perte de poids (en grammes) tout au long de la période expérimentale (Fig. 1C). L'administration systémique de tampon citrate de sodium (SCB), le véhicule de la STZ, n'a pas altéré la glycémie ni la prise de poids par rapport aux rats témoins naïfs.

Le PBMT diminue l'hyperalgésie des rats DT1 sans modifier leur glycémie ni leur poids. (A) Glycémie matinale moyenne (ligne rouge) des rats pendant le protocole d'induction du DT1 par plusieurs faibles doses de STZ ; ligne noire horizontale pointillée : seuil de diabète établi (glycémie ≥ 250 mg/dL). (B) Les rats des groupes STZ (ligne rouge) et STZ + PBMT (ligne verte) ont montré des niveaux élevés d'hyperglycémie à 7, 14, 21, 24 et 28 jours. (C) Les rats des groupes STZ (ligne rouge) et STZ + PBMT (ligne verte) ont cessé de prendre du poids après l'installation du diabète. (D) Les données des seuils de sevrage mécanique (Δ ; g ; l'intensité de l'hyperalgésie) montrent que le PBMT a réduit significativement l'intensité de l'hyperalgésie du groupe STZ + PBMT (ligne verte) par rapport au groupe STZ (ligne rouge), à ​​la 24e et 28e jours. (E) Bargraphe soulignant l'effet anti-hyperalgésique du PBMT pendant la période comprise entre le 21ème et le 28ème jour. Dans (A–C), le symbole (***) signifie une différence significative (p < 0,001) entre les groupes de diabétiques et les témoins (Two-way ANOVA suivi du test posthoc de Bonferroni). Dans (D) et (E), les symboles (**) et (***) signifient une différence significative (p < 0,01 et p < 0,001, respectivement) entre les groupes STZ et STZ + PBMT (Two-way ANOVA suivi de Bonferroni posthoc test); le symbole (#) signifie une différence significative (p <0,001) entre les groupes induits par la STZ par rapport aux groupes témoins (ANOVA à deux facteurs suivi du test posthoc de Bonferroni [D] ; ANOVA à un facteur suivi du test posthoc de Bonferroni [E]). Les données sont exprimées en moyenne ± SEM ; les lignes noires pointillées verticales indiquent la période PBMT.

La STZ est un antibiotique diabétogène connu pour sa capacité sélective à tuer les cellules bêta pancréatiques (cellules β), couramment utilisées pour le modèle DT1 chez le rat67,68,69,70. La STZ est absorbée par le transporteur de glucose des cellules β GLUT2 et déclenche des mécanismes immunitaires68,69. Selon Wang et Gleichmann68,69, la STZ restreint l'expression de GLUT2 in vivo et in vitro lorsqu'elle est administrée via plusieurs protocoles à faible dose, une méthode qui vise à produire moins d'effets secondaires de la STZ, tels que la neurotoxicité. En général, les rats soumis à des injections de STZ présentent des déficits de production d'insuline, entraînant une hyperglycémie et, par conséquent, une polydipsie et une polyurie70. Tous ces signaux de diabète ont été observés chez des rats soumis au protocole STZ à faibles doses (groupes STZ et STZ + PBMT), caractérisant ainsi un modèle reproductible d'induction du diabète, comme le montrent les études précédentes de notre groupe66,71,72,73,74 .

Les rats diabétiques, soumis ou non au PBMT (groupes STZ + PBMT et STZ, respectivement), ont montré des niveaux similaires d'hyperglycémie aux jours 21, 24 et 28 du protocole expérimental (454,94 ± 37,10 mg/dL). La même chose a été observée concernant le poids des rats, une fois que ce paramètre ne dépendait que de l'état diabétique et non du PBMT. De la même manière, le PBMT n'a eu aucune influence sur les rats sains (témoins, non diabétiques et non hyperalgésiques; groupe SCB + PBMT), comme le montrent les figures 1B, C. Nos résultats corroborent l'étude réalisée par Peplow et ses collègues75, dans laquelle la PBMT (660 nm ; 100 mW ; 4,7-6,3 J/cm2 ; 20 s) appliquée pour la cicatrisation des plaies chez les patients diabétiques ne modifie pas l'hyperglycémie ou l'état métabolique des patients. .

Les données reproduisaient les résultats antérieurs obtenus de notre groupe de recherche66. Au 21e jour (après la première séance de PBMT), il n'y avait pas de réduction de l'intensité de l'hyperalgésie mécanique (Δ seuil de retrait, g). Cependant, aux 24e et 28e jours, une réduction significative dans le temps (p < 0,01 et p < 0,001, respectivement) a été observée dans l'intensité de l'hyperalgésie dans le groupe STZ + PBMT par rapport au groupe STZ. Néanmoins, lorsque le PBMT a été appliqué à des rats témoins (groupe SCB + PBMT), il n'y a eu aucun changement dans les seuils de retrait mécanique dans une condition similaire observée dans les groupes SCB (véhicule) et naïf, comme le montre la Fig. 1D, E (le dernier en détail pour la période PBMT).

La PBMT est utilisée depuis longtemps pour le traitement clinique de la douleur neuropathique avec des résultats satisfaisants76,77, mais ses mécanismes analgésiques ne sont pas entièrement compris. L'inhibition de l'hyperactivité neuronale par la lumière infrarouge semble être l'une des façons dont le PBMT agit directement sur les neurones78,79, et par conséquent sur les résultats de la douleur. Il a été suggéré un effet de neuromodulation car les patients lombalgiques soumis au PBMT (808 nm ; 100 mW ; 8,4 J ; 84 s ; une seule séance) sur les niveaux L4-L5 présentent un soulagement significatif de la douleur52,80. Cet effet modulateur pourrait être la clé de la régulation de l'activité neuronale affectée par l'hyperglycémie en évitant la sensibilité douloureuse.

Notre analyse était basée sur une étude précédente identifiant les altérations dynamiques de la fonction motrice liées au DN74 induit par la STZ. Comme le montrent les Fig. 2A, B, le PBMT a pu améliorer la zone de contact maximale (cm2) et la zone d'impression (cm2) des pattes postérieures des rats après 4 (24e jour) et 8 (28e jour) séances de PBMT. Probablement, ces données suggèrent qu'une amélioration de l'analgésie devrait améliorer la conduction nerveuse. Des différences statistiques ont été observées entre les groupes STZ + PBMT et STZ au cours de ces périodes. Cependant, aucune différence n'a été observée pour le paramètre Stride Length (cm) (Fig. 2C), sauf entre les deux groupes neuropathiques (STZ et STZ + PBMT) et les groupes témoins (Naïve, SCB et SCB + PBMT). Les zones des doigts et du coussinet plantaire (glabres) apparaissaient bien délimitées dans les empreintes de la patte arrière droite (RH) des rats du groupe STZ + PBMT aux jours 24 et 28 (Fig. 2D : e), qui étaient similaires aux observée dans les groupes Naïf et SCB (Fig. 2D : a, b, d), différant ainsi du groupe STZ (Fig. 2D : c). La dernière a montré une réduction de la zone de contact avec une faible résolution des empreintes au 28ème jour.

Les paramètres spatiaux de la marche ont été modifiés dans le DN et contrecarrés par le PBMT. (A) Surface de contact maximale (cm2). (B) Zone d'impression (cm2). (C) Longueur de foulée (cm). Les données sont exprimées en moyenne ± SEM ; les symboles (*) et (***) signifient une différence significative (p < 0,05 et p < 0,001, respectivement) entre les groupes STZ et STZ + PBMT ; le symbole (#) signifie une différence significative (p < 0,001) entre les groupes induits par la STZ (STZ et STZ + PBMT) par rapport aux groupes témoins (naïf ; SCB ; SCB + PBMT) ; ANOVA bidirectionnelle suivie d'un test posthoc de Bonferroni. (D) Le schéma général des empreintes 2D de la patte arrière ; les rats du groupe STZ (c) ont montré une réduction de la zone de contact, délimitée par la ligne pointillée blanche et indiquée par les flèches rouges ; les rats du groupe STZ + PBMT (e) présentaient une zone d'empreinte la plus proche des groupes témoins (flèches rouges). Dans le cadre inférieur droit (f), Body Axis sert de référence pour observer le positionnement de la patte lors de l'analyse.

Selon Zochodne et al.81, le diabète non contrôlé entraîne une atteinte des neurones sensoriels avant l'atteinte des neurones moteurs. La DN est associée à des changements posturaux dans ce processus, impliquant la modification du positionnement du pied pendant la marche82 et des modifications de la pression appliquée tout au long de la phase debout83,84. Notre groupe a démontré que l'intensité maximale (au) était le principal paramètre altéré le 14e jour après le début des injections de STZ74, ce qui concorde avec les résultats précédents d'autres groupes84. Les animaux diabétiques, qui présentaient une diminution du seuil mécanique au 14ème jour, ont appliqué moins de pression lors du contact des pattes avec le sol en verre du système CatWalk XT. Ces découvertes suivent le modèle de changements sensoriels dans la DN, également connu sous le nom de "bas et gant", qui se produit comme un trouble sensoriel des extrémités des membres, compromettant la fonctionnalité2,85.

Peu d'études ont évalué l'influence de la PBMT sur les paramètres moteurs dans des modèles animaux, principalement lorsque le système CatWalk XT a été utilisé. La myonécrose locale induite par le venin de serpent provoque une posture semi-infléchie du membre postérieur atteint 3 h après l'injection de venin. Cependant, le PBMT appliqué à la même période à l'aide du laser GaAs (904 nm ; 4 J/cm2) ramène l'intensité maximale (ua), le support (s) et l'équilibre (s) à des valeurs similaires au contrôle60. Bien que les rats hyperglycémiques n'aient pas présenté de demi-flexion des membres postérieurs, ils ont appliqué moins de pression (représentée par moins d'intensité et une plus petite surface de contact avec les pattes) pendant la marche. Par conséquent, le PBMT pourrait normaliser, au moins en partie, la démarche altérée des rats hyperglycémiques en conséquence d'un effet anti-hyperalgésique favorisé par cette thérapie. Dans l'ensemble, il est plausible de suggérer que la douleur neuropathique dérivée du diabète résulte probablement d'une altération des neurones sensoriels et moteurs.

Pour étudier plus avant si l'effet anti-hyperalgésique de la PBMT pouvait être associé à la réduction des cytokines dans le DRG, nous avons analysé les concentrations de TNF-α, IL-1β, IL-6, CINC-1 et IL-10 par dosage immunologique ELISA. Comme le montrent les Fig. 3B, E, l'hyperglycémie a augmenté le niveau d'IL-1β et d'IL-10, respectivement, alors qu'elle n'a pas affecté le TNF-α, l'IL-6 et le CINC-1 (panneaux A, C et D, respectivement). Cependant, le PBMT a diminué toutes les cytokines analysées indépendamment de l'hyperglycémie (Fig. 3). En accord avec nos résultats, l'hyperglycémie augmente particulièrement le niveau de la cytokine pro-inflammatoire IL-1 β et de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 dans DRG10. De plus, les niveaux de TNF-α, IL-6 et CINC-1 n'étaient pas affectés par l'hyperglycémie, suggérant un fond inflammatoire pur dans la DN. Néanmoins, cette étude n'a pas analysé d'autres paramètres inflammatoires, tels que la migration des cellules polymorphonucléaires. Cependant, les données de cette étude ont démontré que la PBMT diminuait le niveau de cytokines dans les DRG, y compris celles augmentées par l'hyperglycémie.

Effets du PBMT sur les niveaux de DRG de TNF-α, IL-1β, IL-6, CINC-1 et IL-10. (A) Il n'y a pas eu d'augmentation des niveaux de TNF-α (pg/mL) dans le groupe STZ (symboles rouges) ; le groupe STZ + PBMT (symboles verts) a montré une réduction significative des niveaux de TNF-α (pg/mL) par rapport à tous les autres groupes. (B) Pour les niveaux d'IL-1β (pg/mL), il y a eu une augmentation significative dans le groupe STZ (symboles rouges) par rapport à tous les autres groupes. (C) Les niveaux d'IL-6 (pg/mL) ont été réduits de manière significative dans les groupes SCB + PBMT (symboles bleus) et STZ + PBMT (symboles verts), par rapport à tous les autres groupes. (D) Les concentrations de CINC-1 (pg/mL) ont montré une réduction significative dans le groupe SCB + PBMT (symboles bleus) uniquement. (E) Les niveaux d'IL-10 (pg/mL/mg) ont montré une augmentation significative dans le groupe STZ (symboles rouges) par rapport à tous les autres groupes. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM ; les symboles (*) et (**) signifient p < 0,05 et p < 0,01, respectivement ; le symbole (#) signifie que tous les groupes témoins sont significativement différents du groupe STZ (p < 0,05) ; ANOVA à un facteur suivi d'un test posthoc de Bonferroni.

Bien que la physiopathologie de la douleur neuropathique dépende de chaque type de neuropathie, l'utilisation de PBMT (660 nm ; 30 mW ; 9 J/cm2 ; 60 s ; 7 jours consécutifs ; 63 J/cm2 densité d'énergie cumulée) dans l'hyperalgésie induite par le nerf sciatique Le modèle de constriction provoque une réduction des cytokines pro-inflammatoires, telles que le TNF-α, l'IL-1β et le HIF-1α (hypoxia-inducible factor-1α)86. De même, il a été décrit une réduction des niveaux de TNF-α par PBMT (950 nm ; 2,5 J/cm2 ; 32 s ; 15 jours consécutifs ; 37,5 J/cm2 de densité d'énergie cumulée) chez des souris modèle de lésion par écrasement du nerf sciatique87. Ces lambeaux de preuves suggèrent la capacité anti-inflammatoire du PBMT. À cet égard, les effets anti-inflammatoires promus par le PBMT ont été précédemment observés dans un modèle d'inflammation induite par la carraghénane, dans lequel des lasers de bas niveau de 660 nm et 684 nm (30 mW ; 7,5 J/cm2 ; 196 s ; un seul point ) a réduit la formation d'œdèmes et la migration des cellules inflammatoires 4 h après les injections de carraghénanes88.

Les cytokines inflammatoires peuvent activer divers récepteurs de la membrane cellulaire, transmettant ainsi des signaux environnementaux, et dans plusieurs lignées cellulaires, l'activation des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et des récepteurs tyrosine kinases (RTK) active les MAPK89. Les cascades de signalisation MAPK sont des voies conservées au cours de l'évolution liées à la transduction du signal intracellulaire en réponse à divers stimuli extracellulaires90. MAPK contrôle de nombreux processus cellulaires, tels que la croissance, la prolifération, la différenciation, la motilité, la réponse au stress, la survie et l'apoptose91. Les trois groupes de MAPK (p38 ; ERK1/2 ; JNK) peuvent être activés par des perturbations osmotiques dérivées du glucose, de la voie des polyols, du stress oxydatif et des produits finaux de glycation avancée (AGE)92. Ces événements sont fortement impliqués dans l'étiologie de la DN1.

Pour examiner une éventuelle interaction entre l'inflammation et la voie MAPK, nous avons en outre évalué l'expression des gènes et des protéines MAPK dans les DRG L4-L5, une fois que ces cibles moléculaires sont supposées être altérées dans la DN, en raison d'une condition imposée par le diabète non contrôlé92. Avant les expériences de PCR quantitative en temps réel, les amorces pour les gènes cibles (p38, ERK1/2 et JNK) et domestiques (contrôles endogènes : Arfgef1 et Serpinb6) ont été testées pour leur efficacité par la construction de la courbe standard. Cela a été fait à travers des dilutions en série d'ADNc naïf (1: 4; 1: 8; 1: 16; 1: 32; 1: 64) et une concentration d'amorce fixe (100 nM). Une efficacité élevée a été observée pour toutes les amorces testées, y compris les témoins endogènes (99,9 ; r2 0,98) (données non présentées). Ensuite, l'expression des gènes cibles a été normalisée par les valeurs moyennes de Ct (seuil de cycle) à partir d'un pool d'expression des gènes Arfgef1 et Serpinb6.

Dans cette étude, nous avons observé une augmentation significative de l'expression de l'ARNm de p38 dans le groupe STZ par rapport aux groupes Naïve, SCB (véhicule) (p < 0,01) et SCB + PBMT (p < 0,001 ; test t de Student non apparié). De plus, l'expression de l'ARNm de p38 dans le groupe STZ était significativement plus élevée par rapport au groupe STZ + PBMT (p <0, 05; test t de Student non apparié), comme le montre la figure 4A. Une fois que le PBMT ne modifie pas la glycémie, nous concluons que cet effet est associé à une hyperalgésie, évidente uniquement dans le groupe STZ. Aucune différence dans l'ARNm de p38 n'a été observée entre les groupes STZ + PBMT, SCB et Naïve. De légères différences entre les groupes concernant l'expression de l'ARNm de ERK1 / 2 et JNK n'étaient pas significatives (Fig. 4B, C).

Expression quantitative de l'ARNm de MAPK. Les valeurs d'expression génique de p38 (A), ERK1/2 (B) et JNK (C) ont été normalisées par un pool d'expression de contrôles endogènes (Arfgef1 et Serpinb6). Le PBMT a diminué l'expression de l'ARNm de p38 chez les rats hyperalgésiques (groupe STZ + PBMT). L'hyperglycémie a augmenté l'expression de l'ARNm de p38, mais pas ERK1/2 et JNK dans les DRG associés à l'hyperalgésie. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM ; symboles (*), (**) et (***) signifient p < 0,05, p < 0,01 et p < 0,001 (respectivement) dans les comparaisons entre STZ (symboles rouges) et les autres groupes (naïfs, symboles noirs ; SCB, symboles gris ; SCB + PBMT, symboles bleus ; STZ + PBMT, symboles verts) ; Test t de Student non apparié.

Les expériences d'immunofluorescence (IF) ont également révélé une augmentation plus élevée de l'expression de MAPK activée, en particulier de p-p38, dans le groupe STZ (Fig. 5H, I). La fluorescence concernant la phosphorylation de p-38 chez les rats hyperalgésiques a été réduite par l'application de PBMT dans la région DRG, comme le montre le groupe STZ + PBMT, dans lequel il y avait une partie de l'activation de p-38 mais dans un nombre inférieur de neurones dans comparaison avec le groupe STZ (Fig. 5K, L). Pour les groupes STZ et STZ + PBMT, l'activation de p38 était fortement concentrée dans les noyaux des neurones afférents DRG, comme le montre la co-coloration DAPI (Fig. 5I, L en détail). Outre le nombre inférieur de neurones positifs pour p-p38 dans le groupe STZ + PBMT, il a également été possible d'observer une intensité de fluorescence plus élevée dispersée dans le cytoplasme des neurones avec certaines conformations de type vésicule (Fig. 5K, L en détail). Cependant, la signification de cette différence par rapport aux rats hyperalgésiques non PBMT (groupe STZ) n'est pas claire.

Micrographies histologiques DRG de p-p38 MAPK par microscopie confocale. Des coupes transversales DRG de 14 µm d'épaisseur ont été soumises au protocole IF pour la coloration de la phosphorylation p38 endogène dans Thr180 et Tyr182 (B, E, H, K). Le DAPI pour la coloration nucléaire est illustré en (A, D, G, J). Les images de fusion (DAPI + p-p38) sont également affichées en (C,F,I,L). Dans (H) et (K), les flèches blanches pointent vers les zones agrandies. Les détails sont affichés dans le coin gauche de (H,I,K,L). Grossissement : ×40 ; barres d'échelle : 50 µm.

Comme pour les résultats d'expression génique, une faible phosphorylation de la protéine ERK1/2 a été détectée. Cependant, pour les groupes SCB + PBMT et STZ + PBMT (Fig. 6E, K, respectivement), les niveaux d'activation de p-ERK1 / 2 liés à la fluorescence étaient encore plus faibles par rapport aux groupes SCB et STZ (Fig. 6B, H , respectivement). Une observation intéressante concernant le groupe STZ + PBMT est la présence de p-ERK1/2 accumulée au voisinage de la membrane plasmique, comme le montre la Fig. 6K, L (en détail).

Micrographies histologiques DRG de p-ERK1/2 MAPK par microscopie confocale. Coupes transversales DRG de 14 µm d'épaisseur soumises au protocole IF pour la coloration de la phosphorylation de ERK1/2 dans Thr202 et Tyr204 (p44/p42) (B,E,H,K). Le DAPI pour la coloration nucléaire est illustré en (A, D, G, J). Les images de fusion (DAPI + p-ERK1/2) sont également présentées dans (C,F,I,L). Dans (H) et (K), les flèches blanches pointent vers les zones agrandies. Les détails sont affichés dans le coin gauche de (H,I,K,L). Grossissement : ×40 ; barres d'échelle : 50 µm.

Conformément à la phosphorylation de ERK1 / 2, l'application de PBMT dans la région DRG diminue l'expression de p-JNK indépendamment de l'hyperalgésie (groupes SCB + PBMT et STZ + PBMT; Fig. 7E, K, respectivement). Les rats qui ne se sont pas soumis au PBMT ont présenté une expression basale de p-JNK, observée de manière diffuse dans le cytoplasme (groupes SCB et STZ ; Fig. 7B, H, respectivement).

Micrographies histologiques DRG de p-JNK MAPK par microscopie confocale. Les coupes transversales DRG avaient une épaisseur de 14 µm et étaient soumises au protocole IF pour la coloration de la phosphorylation p-JNK endogène dans Thr183 et Tyr185 (p46/p54) (B, E, H, K). Le DAPI pour la coloration nucléaire est illustré en (A, D, G, J). Des images de fusion (DAPI + p-JNK) ont également été montrées dans (C, F, I, L). Dans (B) et (H), les flèches indiquent une coloration diffuse dans le cytoplasme. Grossissement : ×40 ; barres d'échelle : 50 µm.

Il a été démontré que l'activation de MAPK est associée à l'allodynie et à l'hyperalgésie dans différentes conditions pathologiques93,94,95. Le membre le plus étudié de la famille MAPK, p38-MAPK, est généralement activé par le stress extracellulaire et les cytokines pro-inflammatoires, avec un rôle prédominant dans le processus inflammatoire une fois qu'il y a une réduction significative de l'inflammation après l'administration systémique de l'inhibiteur pharmacologique p3896. Les rats, 8 à 12 semaines après le traitement par STZ, ont montré une activation de p38, JNK et ERK1/2 dans le DRG L4-L5, bien qu'avec une activation retardée de JNK, par rapport à p38 et ERK1/241. Il a été suggéré que le TNF-α et l'IL-1β jouent un rôle clé dans le développement et le maintien des états douloureux après une lésion du nerf périphérique97. Une fois que p38 régule la biosynthèse du TNF-α et de l'IL-1β dans le DRG, les deux réductions peuvent aboutir à des effets anti-inflammatoires avec un réflexe positif dans l'analgésie97. Par conséquent, nos données ont montré que le PBMT, un effecteur photophysique et photochimique des événements cellulaires, favorise une réduction du TNF-α et de l'IL-1β associée à une moindre activation (phosphorylation) de p38, ce qui peut aider à expliquer l'effet analgésique de la thérapie.

Bien que nos données aient démontré une diminution, même légère, de l'activation de MAPK par la PBMT, la thérapie au laser (He–Ne ; 632,8 nm ; 4,5 mW ; 3 s chaque carré de 1,8 mm × 1,8 mm) étudiée en culture tissulaire de cellules musculaires squelettiques a démontré une augmentation de ERK1/2, et aucun effet sur l'expression de p38 et JNK98. De plus, l'irradiation laser (Er : YAG ; 2,94 µm ; fluence entre 0,7 et 17,2 J/cm2) dans des cultures de cellules d'ostéoblastes a démontré l'activation de ERK1/2 et aucun effet sur l'expression de p38 et de JNK99. Ainsi, l'effet du PBMT sur l'expression des MAPK peut dépendre du tissu impliqué dans cette thérapie.

Il a été suggéré que l'activation de p38 dans le DRG est initiée par le transport rétrograde de la libération du facteur de croissance nerveuse (NGF) à partir du tissu périphérique, lorsqu'il est enflammé, par exemple. Il augmente la traduction et le transport de TRPV1 (un canal récepteur polymodal) vers le terminal nocicepteur périphérique, contribuant au maintien de la sensibilité à la douleur liée à la chaleur. De plus, p-p38 a été trouvé principalement dans les petits neurones du DRG, suggérant une activation plus élevée dans les fibres sensorielles de type C100.

En complément de la coloration IF de p-p38 dans DRG, il a été analysé plus en détail si son expression était impliquée dans un type particulier de fibres nerveuses, à savoir les fibres de type C (petits neurones DRG ; amyélinisés ; TRPV1+). Des fibres TRPV1+ ont été détectées dans les coupes DRG de tous les groupes expérimentaux. Ils ont été classés comme de type C, avec une intensité de fluorescence et une occurrence plus élevées dans les groupes STZ et STZ + PBMT (Fig. 8K, O, respectivement). La co-coloration des fibres p-p38 et TRPV1 + était largement distribuée (Fig. 8L, P, respectivement), avec une prévalence du signal TRPV1 + (rouge) sur p-p38 (vert) dans le groupe STZ + PBMT, comme indiqué dans Fig. 8P (en détail).

Micrographies histologiques DRG de p-p38 MAPK et co-coloration de TRPV1 par microscopie confocale. Des coupes transversales DRG ont été réalisées en 14 µm d'épaisseur et soumises au protocole IF pour la coloration de la phosphorylation p38 endogène dans Thr180 et Tyr182 (B, F, J, N) et TRPV1 (C, G, K, O). DAPI pour la coloration nucléaire est montré dans (A, E, I, M). Les images de fusion (DAPI + p-p38 + TRPV1) sont également affichées en (D, H, L, P). Le groupe STZ + PBMT a montré une coloration modérée pour p-p38 MAPK (N; flèches blanches) et une coloration accrue pour TRPV1 (O; flèches blanches). Les détails sont affichés dans le coin gauche de (L) et (P). Grossissement : ×40 ; barres d'échelle : 50 µm.

Il existe une corrélation entre TRPV1 et MAPK car l'entrée de Ca2+ via TRPV1 entraîne la libération d'ATP, l'activation du récepteur purinergique P2Y2 et la transactivation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR). Il a été décrit que l'augmentation de [Ca2+]i et la liaison de l'ATP à P2Y2 régulent à la hausse l'IP3 intracellulaire via la phospholipase C (PLC). La régulation à la hausse de l'IP3 conduit à l'ouverture de canaux exploités en magasin (SOC), ce qui provoque la libération de Ca2+ par le réticulum endoplasmique (ER). La précédente transactivation de l'EGFR médiée par TRPV1 incite à la signalisation Ras/Raf/MAPK101.

Le tissu cutané est innervé par des terminaisons nerveuses nociceptives TRPV1+102, facilement exposées au soleil et activées par la lumière ultraviolette (UV). La lumière UV active l'afflux de Ca2+ et le courant cationique non sélectif dans les kératinocytes humains immortalisés (cellules HaCaT)103. Cette activation a été supprimée par la capsazépine, un antagoniste de TRPV1, montrant ainsi une interaction entre la lumière et les canaux TRPV1103. En ce sens, Wang et al.104 ont montré que la PBMT à travers un dispositif laser à 980 nm (3 J/cm2 ; onde continue) induisait un effet thermique et, par conséquent, l'activation de TRPV1 dans les cellules souches d'origine adipeuse. Nos données de DRG suggèrent que le PBMT augmente l'expression de TRPV1 chez les rats hyperalgésiques diabétiques, bien que, comme décrit ci-dessous, le PBMT diminue l'influx de Ca2+ dans la culture de neurones DRG. Cependant, d'autres études devraient être menées pour mieux étudier l'implication de TRPV1 dans l'effet anti-hyperalgésique du PBMT appliqué dans la région DRG des rats hyperglycémiques.

L'activation de la voie MAPK et sa modulation par la PBMT semble être liée à la dynamique du Ca2+ dans les neurones DRG. L'augmentation de l'intensité de fluorescence des neurones DRG colorés au FLUO-4 AM a été observée après les stimuli avec 15 mM de KCl et, surtout, 50 mM de KCl pour tous les groupes (Fig. 9A). Remarquablement, l'augmentation de la fluorescence concernant le Δ[Ca2+]i après un stimulus de 15 mM de KCl a été principalement observée dans les neurones préalablement maintenus dans le milieu hyperglycémique (groupe High-glucose) (Fig. 9B, C). En revanche, les neurones DRG maintenus dans un milieu hyperglycémique (glucose 55 mM) et exposés au PBMT (groupe High-glucose + PBMT) ont montré une diminution significative (p < 0,001) de l'intensité de fluorescence pendant le stimulus KCl 15 mM par rapport au groupe glucose (Fig. 9B, C). Pendant le stimulus KCl 50 mM, qui a été utilisé comme contrôle pour le stimulus de l'influx de Ca2+ dans les neurones réactifs, la principale différence (p < 0,05) a été observée entre l'intensité de fluorescence du groupe Low-glucose par rapport au groupe Low-glucose + Groupe PBMT (Fig. 9D,E). Lorsque le stimulus de KCl 50 mM a cessé, l'intensité de la fluorescence a diminué dans les deux groupes hyperglycémiques, bien qu'elle ne soit pas revenue aux niveaux basaux (Fig. 9D, E).

Le PBMT diminue la dynamique calcique des neurones DRG augmentée par l'hyperglycémie. L'intensité de fluorescence (ΔF = F − F0/F0) a été analysée dans des neurones DRG cultivés dans des milieux à faible (ligne noire) ou à haute teneur en glucose (ligne rouge) pendant 24 h et exposés à du PBMT (lignes vertes et bleues) juste avant le test. . (A) Représentation générale des intensités de fluorescence (ΔF = F - F0/F0) après des stimuli extracellulaires avec 5 mM (basal), 15 mM (intermédiaire) et 50 mM (élevé) de KCl ; ↑[K+]e a été utilisé pour générer un influx de Ca2+ dans les neurones DRG incubés avec FLUO-4 AM. (B) Pendant le stimulus intermédiaire (KCl 15 mM), il y avait une différence significative dans le ΔF lors de la comparaison des groupes High-glucose et High-glucose + PBMT (la comparaison a été faite en considérant le ΔF délimité par les lignes pointillées horizontales) ; ANOVA bidirectionnelle suivie d'un test posthoc de Bonferroni. (C) Images acquises par pression de la culture cellulaire DRG pendant le laps de temps, juste après le stimulus avec 15 mM de KCl. (D) Au stimulus élevé (KCl 50 mM), il y avait une différence significative entre les groupes Low-glucose et Low-glucose + PBMT. (E) Images acquises par pression de la culture cellulaire DRG pendant le laps de temps, juste après le stimulus avec 50 mM de KCl. (F) Pourcentage (%) de cellules sensibles pendant le stimulus de 15 mM ; dans le groupe High-glucose, environ 60 % de toutes les cellules réactives, c'est-à-dire les cellules présentant une fluorescence accrue pendant le stimulus KCl 50 mM (contrôle positif), ont également répondu au stimulus intermédiaire (KCl 15 mM), étant statistiquement différentes des autres groupes. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM ; les symboles (*) et (***) signifient p < 0,05 et p < 0,001, respectivement, par rapport au groupe High-glucose ; ANOVA à un facteur suivi d'un test posthoc de Bonferroni.

Au-delà de l'intensité de fluorescence (Δ[Ca2+]i), nous avons également quantifié le pourcentage (%) de cellules sensibles au KCl 15 mM par rapport au nombre total de neurones sensibles au KCl 50 mM (Fig. 9F). Le % de neurones répondant au stimulus de KCl 15 mM était plus élevé dans le groupe High-glucose par rapport aux groupes Low-glucose (p < 0,001) et High-glucose + PBMT (p < 0,05). Ces données suggèrent que le PBMT réduit la réactivité des neurones DRG augmentée par l'hyperglycémie. Ainsi, il est plausible d'émettre l'hypothèse que l'un des mécanismes analgésiques possibles de la PBMT dans la région DRG est, en même temps, d'augmenter l'expression de TRPV1 dans les neurones DRG via la MAPK p38 induite par l'IL-1β et de désensibiliser les neurones TRPV1+ en diminuant le Ca2+. afflux.

La PBMT pourrait représenter une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l'hyperalgésie neuropathique diabétique, basée sur ses effets photophysiques et photochimiques bénéfiques contre les altérations fonctionnelles, moléculaires et cellulaires observées dans cette maladie, régies par la voie MAPK et la dynamique du calcium.

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel d'éthique de l'utilisation des animaux (CEUA/UNICAMP, numéro de permis 5337-1/2019) et ont suivi les directives ARRIVE. Les expériences ont également été réalisées conformément aux directives du Conseil national brésilien pour le contrôle de l'expérimentation animale (CONCEA) et du Collège brésilien d'expérimentation animale (COBEA). Des rats Lewis mâles (LEW/HsdUnib, Harlan, USA, 1996), âgés de 4 à 8 semaines, pesant 200 à 250 g, fournis par le Centre multidisciplinaire de recherche biologique (CEMIB) de l'Université ont été utilisés. Les rats ont été maintenus dans des cages en plastique avec une litière en sciure de bois (changée trois fois par semaine), à ​​raison d'environ quatre par cage, et ont reçu de la nourriture (nourriture commerciale pour rongeurs) et de l'eau filtrée à volonté, dans une pièce à température et humidité contrôlées de moins de 12/ Cycle obscurité/lumière de 12h.

Les rats ont été divisés au hasard en cinq groupes expérimentaux, composés de huit rats (n = 8) par groupe : naïfs (rats intacts ; n'ont reçu aucune injection et aucun PBMT) ; SCB (a reçu cinq doses du véhicule, un tampon de citrate de sodium 0,1 M et aucun PBMT); STZ (a reçu cinq doses de STZ, 25 mg/kg par dose, et aucun PBMT ); SCB + PBMT (ont reçu cinq doses du véhicule et ont été soumis à PBMT); STZ + PBMT (ont reçu cinq doses de STZ et ont été soumis à PBMT). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre de rats et leurs souffrances.

L'induction du DT1 a été réalisée selon les études précédentes réalisées par notre groupe66,71,72,73,74, consistant en une faible dose de STZ (25 mg/kg) (N-[Méthylnitrosocarbamoyl]-α-d-glucosamine ; Sigma- Aldrich®, St. Louis, MO, USA]), dilué dans le véhicule (tampon citrate de sodium 0,1 M, SCB [pH 4,5]) et injecté par voie intrapéritonéale (ip) une fois par jour, pendant cinq jours consécutifs (STZ et STZ + PBMT groupes). Le même volume de véhicule a été injecté quotidiennement chez les animaux témoins (groupes SCB et SCB + PBMT), allant de 50 à 62,5 µL, selon le poids des rats. Les mesures de la glycémie de la veine caudale ont été effectuées avec un Accu-Chek® Sensor Comfort (Roche Diagnostics®, Allemagne). Le développement de l'hyperglycémie et le poids des rats ont été surveillés les jours 0, 7, 14, 21, 24 et 28 après le début des injections de STZ ou de véhicule.

L'hyperalgésie a été mesurée à travers les seuils de retrait mécaniques, déterminés en appliquant le test électronique de von Frey (Insight®, Ribeirão Preto, SP, Brésil). Nous avons utilisé une pointe de pipette en polypropylène adaptée à un transducteur de force portatif avec une pression croissante dans la surface plantaire des pattes postérieures des rats droit et gauche. L'équipement convertit automatiquement la pression appliquée à la surface mi-plantaire de la patte en gramme-force (g) une fois la patte retirée. Les rats ont été placés au hasard dans des cages individuelles en plastique avec un sol en treillis métallique, suivi de 30 min d'acclimatation avant le test. Des tests électroniques de von Frey ont été appliqués à tous les groupes expérimentaux à 0, 7, 14, 21, 24 et 28 jours après le début de la STZ ou des injections de véhicule, toujours en milieu de matinée, par un examinateur aveugle des groupes et du traitement. Pour le groupe STZ + PBMT, une analyse supplémentaire a été effectuée 19 jours après le début des injections de STZ pour sélectionner uniquement les rats hyperalgésiques pour l'exposition au PBMT.

Le test de piste de marche CatWalk (Noldus Inc., Wageningen, Pays-Bas) consiste en un plancher de verre éclairé avec une caméra vidéo à grande vitesse (Gevicam GP-3360 ; GEViCAM Inc., Milpitas, CA, États-Unis) équipée d'un objectif grand angle (6,0 mm; DF6HA-1B, Fujinon Corp., Chine). La caméra était positionnée sous la passerelle à 56 cm et le logiciel CatWalk™ XT 10.6 enregistrait automatiquement les empreintes de pattes lorsque l'animal traversait la voie dans une voie calibrée de 20 × 10 cm de longueur. La LED verte plus un fond illuminé en rouge crée un contraste dans le sol en verre selon les pas des animaux. Les configurations CatWalk XT ont été configurées selon les paramètres utilisés par Vieira et al.74. Pour l'étude actuelle, nous avons considéré la moyenne entre les pattes postérieures (patte postérieure droite [RH] et patte postérieure gauche [LH]) concernant la zone de contact maximale (cm2), la zone d'impression (cm2) et la longueur de la foulée (cm), qui ont été analysés à 0, 7, 14, 21, 24 et 28 jours après le début des injections de STZ ou de véhicule, toujours l'après-midi avec les lumières de la pièce éteintes. Chaque rat a effectué 3 cycles à chaque période d'analyse, complétant ainsi 24 cycles par groupe et par période.

Les rats des groupes SCB + PBMT et STZ + PBMT ont été soumis au PBMT pendant huit jours (du 21ème au 28ème jour après les injections de STZ ou de véhicule), une fois par jour, toujours le matin. Pour le groupe STZ + PBMT, seuls les rats hyperalgésiques ont été considérés comme recevant le traitement au laser puisque, dans notre modèle DN, environ 20 % des rats recevant des injections de STZ ne sont pas devenus hyperalgésiques (données non présentées). La PBMT a été réalisée avec un appareil laser de classe IIIB Endophoton LLT1307 (KLD Biosistemas Equip. Elet. Ltda®, Amparo, SP, Brésil). Les rats ont été anesthésiés avec de l'isoflurane (3%) (Cristália®, Itapira, SP, Brésil) et l'irradiation laser a été appliquée directement sur la peau rasée du dos du rat en un seul point entre les niveaux de la colonne vertébrale L4-L5, bilatéralement. Les paramètres PBMT sont décrits dans le tableau 1.

Pour les analyses des niveaux de cytokines inflammatoires et de l'expression du gène MAPK, les rats ont été anesthésiés sous isoflurane (3%) (Cristália®) et euthanasiés sans cruauté. Après dissection, les DRG L4 et L5 ont été collectés, congelés instantanément dans de l'azote liquide (− 196, 15 ° C) et stockés à − 80 ° C pour homogénéisation postérieure. Aux échantillons DRG pour les immunoessais ELISA, ont été ajoutés le tampon de lyse et d'extraction RIPA (Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA), contenant de l'orthovanadate de sodium, un inhibiteur de protéase et du PMSF (fluorure de phénylméthanesulfonyle) (Thermo Scientific™). Les échantillons ont été placés dans un homogénéisateur FastPrep® (MP Biomedicals ™, Santa Ana, Californie, États-Unis), puis agités à 4 ° C (5 × 20 s) entre des intervalles de 5 minutes. Après cela, les DRG homogénéisés ont été maintenus sous agitation continue pendant 3 h à 4 ° C, puis centrifugés à 12 000 tr/min pendant 15 min à 4 ° C. Le surnageant résultant a été transféré dans un nouveau tube. Les concentrations de protéines ont été mesurées par le test de Bradford105.

Pour l'expression du gène MAPK par RT-qPCR en temps réel, les DRG ont été fragmentés et homogénéisés dans du TRIzol® (Invitrogen Life Technologies™, Carlsbad, CA, USA) (1 mL/mg) pour isoler l'ARN total, selon les instructions du fabricant. A l'homogénat ont été ajoutés 0,2 ml de chloroforme (Sigma-Aldrich®) et après 3 min de repos à température ambiante, il a été centrifugé à 12 000 tr/min pendant 15 min à 4 °C. La phase aqueuse a été transférée dans un nouveau tube, dans lequel 0,5 mL d'isopropanol a été ajouté. Après une nouvelle centrifugation, le culot a été lavé avec de l'éthanol à 75%, et l'ARN total a été remis en suspension dans de l'eau traitée au DEPC UltraPure™ (Thermo Scientific™). L'ARN DRG total a été quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre à très faible volume (Epoch Microplate Spectrometer, BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA).

Pour l'immunofluorescence DRG (IF), les rats ont été anesthésiés avec de la kétamine (85 mg/kg, ip) et de la xylazine (10 mg/kg, ip), puis saignés par perfusion cardiaque (par l'aorte ascendante) avec une solution saline (0,9 % de NaCl, 200 mL). Après exsanguination, les rats ont été perfusés avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA, pH 7,4, 4 °C, 300 mL). Ensuite, les DRG L4 et L5 ont été collectés et post-fixés dans du PFA à 4 % pendant une nuit à 4 °C, suivis de 48 h dans du saccharose à 30 % à 4 °C. Des DRG individuels ont été intégrés dans un composé Tissue-Tek® OCT (Sakura® Finetek, Californie, États-Unis) et des coupes non sériées de 14 µm ont été réalisées sur un cryostat (Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne) à l'aide de lames gélatinisées.

Pour IL-1β, TNF-α, IL-6 et CINC-1 ont été utilisés des plaques à 96 puits via le kit DuoSet® ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), et les résultats ont été exprimés en picogrammes par millilitre (pg/mL). Pour l'IL-10, les concentrations ont été mesurées grâce au kit ELISA RayBio® Rat IL-10 (#ELR-IL10) (RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA), et les résultats ont été exprimés en picogrammes par millilitre par milligramme (pg/ mL/mg) de tissu. Les instructions du fabricant ont été suivies pour les deux kits ELISA. L'absorbance a été déterminée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques Asys UVM 340 (Biochrom Ltd., Cambridge, Royaume-Uni), et les résultats ont été obtenus en comparant la densité optique aux densités de la courbe standard.

500 ng d'ARN total extraits des DRG L4 et L5 ont été soumis à une synthèse d'ADNc (SuperScript™ VILO™ cDNA Synthesis Kit, Invitrogen Life Technologies™) selon le protocole du fabricant. Des amorces spécifiques pour les gènes p38, ERK1/2, JNK, Arfgef1 et Serpinb6 ont été conçues avec l'outil "Pick Primers", disponible sur NCBI/Primer-blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast) et synthétisé commercialement. Les amplicons ont été réglés sur moins de 200 paires de bases, et les dimères, les dimères croisés et les épingles à cheveux ont été éliminés lors de la conception des amorces (ou ont été réduits au minimum). Les séquences d'amorces sont décrites dans le tableau 2. La température d'hybridation a été fixée à 60 ° C et la teneur en GC (guanine-cytosine) était de 50 à 55 %.

La méthode 2−ΔΔCt106 a effectué une analyse de l'expression génique relative à un indice de contrôle interne. Les réactions ont été réalisées au StepOne Plus Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) en utilisant SYBR Green comme signal fluorescent (Power SYBR™ Green PCR Master Mix, Applied Biosystems, USA) et 1:10 de l'ADNc obtenu à partir de chaque échantillon.

Les sections DRG ont été incubées dans de la glycine 0, 1 M pendant 30 min, suivies d'un blocage avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 2% et d'une perméabilisation dans du Triton X-100 à 0, 2% pendant 1 h à température ambiante. Pour l'anti-phospho-p44/42 MAPK (ERK 1/2) et l'anti-phospho-SAPK/JNK, une étape supplémentaire a été effectuée avant le blocage de la BSA à 2 %, consistant en une perméabilisation du méthanol à 100 % à - 20 °C. Ensuite, les sections ont été incubées dans du PBS 0, 1 M plus 0, 1% de Triton-100 et 1% de BSA pendant une nuit dans une atmosphère humide à 4 ° C avec les anticorps primaires spécifiques. Les anticorps suivants ont été utilisés : anti-phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (D3F9) XP® Rabbit mAb (1:500) ; anti-phospho-p44/42 MAPK (ERK 1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) mAb de lapin XP® (1:200); et mAb de souris anti-phospho-SAPK/JNK (Th183/Tyr185) (G9) (1:400), tous de Cell Signaling Technology® (Danvers, MA, USA). Après la période d'incubation, les coupes ont été lavées deux fois dans la même solution d'incubation (sans les anticorps) puis lavées 5 fois dans du PBS 0,1 M, 5 min à chaque fois. Les coupes ont ensuite été incubées avec les anticorps secondaires (âne anti-lapin ou anti-souris Alexa 488, 1:1000, #A21206, Thermo Scientific™) dilués dans la même solution d'anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante. Après incubation, les sections DRG ont été lavées avec du PBS 0,1 M cinq fois pendant 5 min.

Les noyaux ont été colorés avec du dichlorhydrate de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 0,25 µg/mL, D9542, Sigma-Aldrich®) dilué dans du PBS 0,1 M, pendant 10 min à température ambiante et les coupes ont été couvertes à l'aide de Vectashield® ( Vector Laboratories, Burlingame, Californie, États-Unis). Des témoins négatifs ont été préparés sans incubation dans des anticorps primaires pour confirmer la liaison non spécifique. Les lames ont d'abord été examinées dans un microscope inversé à épifluorescence Leica DMi6000 B couplé à une caméra DFC360 FX et une source de lumière fluorescente Leica CTR7000HS (Leica Microsystems). Après la confirmation de la fluorescence positive, les images finales ont été obtenues dans un microscope confocal à balayage laser Zeiss Axio Observer Z1 LSM780-NLO (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne), à ​​l'aide de l'EC Plan-Neofluar 20x/0.50 Dry and Objectif EC Plan-Neofluar 40×/1.30 Oil DIC.

La culture cellulaire primaire des neurones DRG a été réalisée selon le protocole décrit par Linhart et al.107 et modifié par notre groupe de recherche tel que publié par Manzo et al.108 et do Prado et al.73. Des rats Lewis mâles sains (LEW/HsdUnib, Harlan, USA, 1996) pesant environ 200 g, âgés de 4 semaines, ont été utilisés. Les rats ont été euthanasiés sans cruauté sous anesthésie profonde (3% Isoflurane; Cristália®) suivie d'une décapitation. Seize à vingt DRG thoraciques et lombaires ont été collectés et placés dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, contenant 10 mM d'HEPES). Ensuite, les cellules ont été dissociées par incubation avec du HBSS contenant 0,28 U/mL de collagénase de type II pendant 60 min à 37 °C suivi de 6 min dans 0,25 mg/mL de trypsine. Pour l'inhibition de l'action de la trypsine, les cellules ont été lavées deux fois dans du DMEM additionné de sérum bovin fœtal (FBS ; 10 %), 50 U/mL de pénicilline et 50 mg/mL de streptomycine. Les cellules dissociées mécaniquement ont été étalées sur des lamelles recouvertes de laminine et de poly-d-lysine et maintenues à 37 ° C et 5% de CO2. Toutes les fournitures de culture cellulaire ont été achetées auprès de Sigma-Aldrich®, à l'exception du FBS, acheté auprès de Vitrocell Embriolife (Campinas, SP, Brésil).

Après l'achèvement de 24 h d'incubation sous milieu cellulaire normoglycémique (5,5 mM de glucose) ou hyperglycémique (55 mM de glucose), les neurones DRG sensoriels ont été exposés à la PBMT avec les mêmes paramètres décrits dans le tableau 1 mais avec un contact indirect par le "mouvement de balayage" , où la sortie de la sonde laser était maintenue à une distance de 1 cm du milieu cellulaire. Immédiatement après l'irradiation, les neurones cultivés en DRG ont été incubés dans du HBSS contenant 10 µM de FLUO-4, AM et 1 % de PowerLoad (Thermo Scientific™) pendant 40 min, à l'abri de la lumière à 37 °C et 5 % de CO2. Des lamelles ont été insérées dans une chambre de perfusion (Warner Instruments, Holliston, MA, USA) et placées sur un microscope inversé Leica DMi6000 B couplé à une caméra DFC360 FX et une source de lumière fluorescente Leica CTR 7000 HS (excitation 480 nm, 527/30 nm filtres de suppression) (Leica Microsystems). Un système de valve contrôlé par ordinateur (Warner Instruments) a été utilisé pour la perfusion cellulaire avec différentes molarités de KCl [5 mM (basal), 15 mM (partiel) et 50 mM (maximum)], et le débit a été réglé à 5 mL/ min (changement complet du volume de la chambre toutes les 2 s)73,108. Les images ont été prises au rythme d'une image/s, et les valeurs d'intensité de fluorescence (Δ[Ca2+]i) ont été normalisées par ΔF/F0, où ΔF est égal à la fluorescence finale (F) moins la fluorescence basale (F0). Les données ont également été présentées sous forme de % de cellules sensibles au KCl 15 mM par rapport au nombre total de cellules sensibles au KCl 50 mM, dans quatre situations distinctes : (i) lorsque les cellules ont été incubées dans un milieu à faible teneur en glucose ; (ii) faible teneur en glucose plus PBMT ; (iii) riche en glucose ou (iv) riche en glucose plus PBMT.

Pour les comparaisons entre les groupes et la durée du traitement, nous avons utilisé une ANOVA à deux facteurs suivie d'un test posthoc de Bonferroni. L'ANOVA unidirectionnelle a effectué d'autres comparaisons entre trois groupes ou plus, suivies du test posthoc de Bonferroni. Pour les comparaisons entre deux groupes seulement, nous avons utilisé un test t de Student non apparié. p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) et p < 0,001 (***) ont été considérés comme statistiquement significatifs. Tous les tests statistiques ont été effectués sur le logiciel GraphPad Prism®, versions 5 et 7. Les valeurs numériques ont été exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM).

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant [CAP].

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Cette étude a été financée par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP) (Subventions 2014/25153-7 ; 2015/12673-5 ; 2018/05108-8) et par la Coordination pour l'amélioration du personnel de l'enseignement supérieur (CAPES). Nous tenons à remercier l'Institut national des sciences et de la technologie photonique appliquée à la biologie cellulaire (INFABiC ; Campinas, Brésil) pour son soutien à l'acquisition d'images ; nous remercions également César Eduardo Bissoto pour tout le support technique.

Département de biologie structurale et fonctionnelle, Institut de biologie, Université de Campinas (UNICAMP), Carl von Linnaeus n/n, Cidade Universitária Zeferino Vaz, Campinas, SP, 13083-864, Brésil

Willians Fernando Vieira, Kauê Franco Malange, Silviane Fernandes de Magalhães, Júlia Borges Paes Lemes, Gilson Gonçalves dos Santos, Catarine Massucato Nishijima, Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, Maria Alice da Cruz-Höfling, Cláudia Herrera Tambeli & Carlos Amilcar Parada

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WFV et CAP ont conçu l'étude ; WFV, KFM, SFM, JBPL, GGS et CMN ont réalisé les expériences ; WFV, ALRO, MACH, CHT et CAP ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné de manière critique le manuscrit et l'ont approuvé pour soumission.

Correspondance à Carlos Amilcar Parada.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Vieira, WF, Malange, KF, de Magalhães, SF et al. Les effets anti-hyperalgésiques de la thérapie de photobiomodulation (904 nm) sur la neuropathie diabétique induite par la streptozotocine impliquent la modulation de la voie MAPK et de la dynamique du calcium. Sci Rep 12, 16730 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19947-2

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Reçu : 30 avril 2022

Accepté : 06 septembre 2022

Publié: 06 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-19947-2

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